桑叶总黄酮提取纯化工艺及抗氧化性研究

苏 伟,万 聆,简素平,黄立山,陈 钢,*

(1.江西科技师范大学生命科学学院,江西南昌 330013; 2.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)

桑属桑科植物是我国传统的药食两用植物,在亚洲多个国家广泛种植[1-2]。千百年来,由于其叶子的低毒性和生物活性(如抗高血压[3]、抗高血糖[4-5]、抗凝血[6]等),被中医作为一种用来治疗疾病的草药。随着桑叶活性成分的深入研究,发现黄酮类化合物是桑叶中重要的活性成分[7-8],并对桑叶的药理功效起着关键性的作用。我国桑树资源丰富,而桑叶在我国大多是作为蚕的食物,有关桑叶的深加工不多,有效成分的利用程度不够[9-10]。因此,将桑叶中的有效成分提取纯化,实现其高价值利用成为研究热点。

目前,对于桑叶黄酮提取工艺的研究主要有传统溶剂提取[11]、超声波辅助提取[12]、微波辅助提取[13]、超临界CO2提取[14]等。超声波是一种空化机械波,其产生的空化效应可以加速活性物质的溶出[15],运用超声辅助提取天然活性物质不仅可以提高得率,还能避免提取温度过高而对活性物质产生破坏作用,还具有缩短提取时间的作用[16-17],超声辅助提取法还可以减少有机试剂的使用量,具有一定的环保效果[18]。

因此,本研究以霜桑叶为材料,研究乙醇浓度、料液比、超声时间和超声温度对桑叶黄酮提取率的影响,通过Design-Expert试验设计及响应面分析法对桑叶黄酮超声辅助提取工艺进行优化,并运用AB-8型大孔树脂对粗提物进行纯化,以期提高桑叶黄酮的提取率与纯度,增加桑叶黄酮提取物的活性,为桑叶产业的综合利用和桑叶黄酮的进一步开发提供一定理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑叶 亳州市京皖中药饮片厂,烘干后粉碎过40目筛;芦丁标准品 Solarbio科技有限公司;过氧化氢、亚硝酸钠、无水乙醇、硝酸铝、氢氧化钠 均化学纯,西陇化工有限公司;AB-8大孔树脂 天津波鸿树脂有限公司。

UV-2000型紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;TDZ5-MS自动平衡离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;鼓风干燥箱 精宏设备实验有限公司;SB-5200DT超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;RE-52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;DHL-A 恒流泵、DBS-100全自动部分收集器 上海青浦沪西仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 桑叶→粉碎、过筛→超声辅助提取→乙醇醇沉4次→过大孔树脂纯化→旋转浓缩→冷冻干燥→桑叶总黄酮

桑叶经温度65 ℃,时间6 h烘干后,粉碎过40目筛,在条件为超声波输出功率为450 W超声处理75 min,超声温度40 ℃,乙醇浓度80%,料液比1∶30 g/mL的条件下进行提取桑叶总黄酮,按1∶8 g/mL加入无水乙醇醇沉,醇沉时间12 h,醇沉4次。然后用AB-8型大孔树脂纯化。将得到的洗脱液经旋转蒸发仪蒸发至无乙醇味,再经冷冻干燥得到总黄酮。

1.2.2 总黄酮的测定 准确称取芦丁标准品10.0 mg,用60%乙醇溶解于50 mL容量瓶,得到200 mg/L的芦丁标准溶液。取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的标准溶液置于6根20 mL试管中,加入3 mL 60%乙醇溶液,分别再加入1 mL 5% NaNO2溶液,摇匀。6 min后加入1 mL 10% Al(NO3)3溶液,摇匀,静置6 min后加入4% NaOH溶液4 mL,再加60%乙醇定容至10 mL,摇匀,静置15 min后在510 nm处测定吸光度值[19-20]。根据测得数据计算标准曲线方程为y=12.436x-0.0035,R2=0.9995,式中x为芦丁浓度(mg/mL),y为吸光度。

提取完成后真空抽滤,将滤液定容到250 mL的容量瓶中,按照绘制标准曲线的方法测定黄酮含量并计算得率。

式中:A:测定黄酮提取液的吸光度;m:桑叶粉末质量(g);b:标准曲线方程纵截距;a:标准曲线方程横截距。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 乙醇浓度对桑叶总黄酮得率的影响 称取1 g桑叶,设置超声波输出功率为450 W,在超声时间70 min、超声温度40 ℃、料液比1∶30 g/mL条件下,测定乙醇浓度在40%、50%、60%、70%、80%、90%的条件下桑叶总黄酮的得率。

1.2.3.2 料液比对桑叶总黄酮得率的影响 称取1 g桑叶,设置超声波输出功率为450 W,在乙醇浓度70%、超声时间70 min、超声温度40 ℃条件下,测定料液比在1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g/mL的条件下桑叶总黄酮的得率。

1.2.3.3 超声时间对桑叶总黄酮得率的影响 称取1 g桑叶,设置超声波输出功率为450 W,在乙醇浓度70%、料液比1∶30 g/mL、超声温度40 ℃条件下,测定超声时间在40、50、60、70、80、90 min的条件下桑叶总黄酮的得率。

1.2.3.4 超声温度对桑叶总黄酮得率的影响 称取1 g桑叶,设置超声波输出功率为450 W,在乙醇浓度70%、料液比1∶30 g/mL、超声时间70 min条件下,测定超声温度在30、35、40、45、50、55 ℃的条件下桑叶总黄酮的得率。

1.2.4 响应面试验 在单因素试验基础上,以乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声时间(C)和超声温度(D)4个因素作为提取工艺的影响因子,以总黄酮得率为考察指标,采用响应面试验设计方法,对桑叶总黄酮提取工艺进行优化,并找出最佳工艺条件[21-22]。响应面试验因素水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平设计Table 1 Response surface test factor level

1.2.5 大孔树脂纯化 取预处理好的AB-8型大孔树脂,装入26 mm×300 mm的层析柱。在上样pH为4.24、上样流速为2 mL/min、洗脱液为70%乙醇、洗脱液流速为2 mL/min的条件下进行纯化[23-24]。将得到的洗脱液经旋转蒸发仪蒸发至无乙醇味,再经冷冻干燥得到总黄酮。

1.2.6 桑叶总黄酮对过氧化氢的清除作用 取2 mL浓度为800 μmol/L的过氧化氢(在磷酸钾缓冲液pH=7.42中制备)与2 mL不同浓度(浓度分别是10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)的桑叶黄酮混合,并将混合液在室温下静置10 min在230 nm处测量吸光度,采用以下公式计算对过氧化氢的清除率[25]:

式中:A样品:添加桑叶黄酮在560 nm吸光度;A对照:添加过氧化氢在560 nm吸光度。

1.3 数据分析

响应面设计采用Design Expert V8.0.5统计分析软件,图形制作采用Excel和Origin Pro 8.0数据处理软件(n=3)。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对桑叶总黄酮得率的影响 如图1所示,桑叶总黄酮的得率随乙醇浓度的增大先增大而后减小,在乙醇浓度为80%的时候达到最大。当乙醇浓度超过80%,乙醇浓度继续增加则导致提取率降低。原因可能是高浓度的乙醇溶液会增大整个提取体系的粘度,不仅降低总黄酮的析出,还会增大其他杂质的析出[26]。

图1 乙醇浓度对桑叶总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on theextraction rate of total flavonoids from mulberry leaves

2.1.2 料液比对桑叶总黄酮得率的影响 如图2所示,在料液比小于1∶30 g/mL时,得率随着料液比的增大而增大。当料液比超过1∶30 g/mL时,得率则出现下降的趋势。原因可能是在1∶30 g/mL的时候总黄酮的析出趋于稳定,继续增加溶剂会提高其他杂质的析出[27]。

图2 料液比对桑叶总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ratio of material to liquid onextraction rate of total flavonoids from mulberry leaves

2.1.3 超声时间对桑叶总黄酮得率的影响 如图3所示,桑叶总黄酮的得率先增大后减小,在70 min的时候得率达到最大值,而后随着时间的增加得率逐渐降低。原因可能是在70 min后,由于提取时间的过长,有部分黄酮发生了氧化反应降低了总黄酮的含量[28]。

图3 超声时间对桑叶总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on theextraction rate of total flavonoids from mulberry leaves

2.1.4 超声温度对桑叶总黄酮得率的影响 如图4所示,以40 ℃为拐点,桑叶总黄酮得率先随着温度的升高而增大,然后随着出现降低的现象。降低的原因可能是随着温度的提高加大了反应体系中可溶性蛋白的变性,使得整个体系的黏度增大,影响了黄酮类物质的溶出[29]。

图4 超声温度对桑叶总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on theextraction rate of total flavonoids from mulberry leaves

2.2 响应面试验优化

2.2.1 响应面实验结果 根据Design-Expert软件设计的实验方案,如表2所示。以乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声时间(C)、超声温度(D)为变量,以桑叶总黄酮的得率(Y)为响应值,进行拟合分析。得到的拟合方程式为:

表2 响应面实验结果Table 2 Results of response surface

Y=2.64+0.082A+0.1B+0.2C+0.14D-0.068AB-0.078AC-0.023AD-0.025BC-0.085BD-0.092CD-0.22A2-0.13B2-0.19C2-0.15D2。

表3 响应面方差分析结果Table 3 Response surface variance analysis

由图5可知,料液比和超声温度、超声时间和超声温度的交互作用对响应值的影响显著;料液比和乙醇浓度、料液比和超声时间、料液比和超声温度、乙醇浓度和超声时间交互作用对响应值的影响不显著;各单因素与桑叶总黄酮的得率都呈二次抛物线关系,表明拟合的回归方程较好。

图5 各因素两两相交作用的响应面Fig.5 Response surface of interaction of two various factors

2.2.2 验证试验 通过Design Expert V8.0.5统计分析软件,对该桑叶总黄酮提取的模型进行预测,得到最佳提取工艺为:乙醇浓度80.57%,料液比1∶31.28 g/mL,超声时间74.32 min,超声温度41.24 ℃,理论得率为2.7%。考虑实际条件将其工艺优化为:乙醇浓度80%,料液比1∶30 g/mL,超声时间75 min,超声温度40 ℃。重复进行三次试验所得的得率结果为2.7%,与理论预测值相同,说明该模型的拟合程度较好。

2.3 大孔树脂纯化桑叶总黄酮

使用AB-8型大孔树脂对粗提物进行纯化,桑叶粗提取粉末中的总黄酮含量为12.3 mg/mL,纯化后总黄酮的含量提高至33.8 mg/mL。粗提液流经大孔树脂,大孔树脂会吸附粗提物中的各种成分。通过水洗和醇洗的方式,将各种成分进行分离纯化,进而提高了提取物中总黄酮的含量[30-31]。

2.4 桑叶总黄酮对过氧化氢的清除作用

过氧化氢可以穿过膜并且在金属离子的存在下氧化许多生物分子并形成羟基。因此,金属螯合和过氧化氢清除过程对于生物体具有重要意义[32-33]。由图6可以看出,桑叶总黄酮和VC都具有较好的清除过氧化氢的能力,桑叶总黄酮的IC50为(45±0.8) μg/mL,而VC的IC50=(80.46±1.4) μg/mL,桑叶总黄酮的清除过氧化氢的能力大于VC。

图6 桑叶总黄酮及VC对过氧化氢的清除作用Fig.6 Scavenging effects of mulberry leaftotal flavonoids and VC on hydrogen peroxide

3 结论

桑叶总黄酮超声辅助提取最佳工艺参数为乙醇浓度80%、料液比1∶30 g/mL、超声时间75 min、超声温度40 ℃,在此条件下,桑叶总黄酮得率为2.7%,经AB-8大孔树脂洗脱纯化后,纯度达33.8%。纯化后桑叶总黄酮抗氧化实验结果表明,桑叶总黄酮的抗氧化能力大于抗坏血酸。相比传统醇提取法,超声波辅助提取使桑叶黄酮得率提高0.8%,该结论为天然抗氧化剂的开发提供理论基础。