菌种接种方式对黄豆酱品质的影响

古小露,谢跃杰,熊政委,王仲明,陈海杨,阮梅蘭,姜美娜,王 强,*

(1.重庆第二师范学院生物与化学工程学院,重庆 400067; 2.重庆第二师范学院脂质资源与儿童日化协同创新中心,重庆 400067; 3.又石大学食品生命工程系,全罗北道全州 55338)

黄豆酱是我国传统发酵豆制品,制曲和发酵是其制作工艺中的关键环节。黄豆酱原料由大豆和面粉组成,在制曲发酵阶段,原料在以霉菌为主的微生物作用下,分解产生多肽、氨基酸、小分子糖类等,为后续发酵提供微生物生长活动所需的基础物质[1],微生物产蛋白酶、淀粉酶和糖化酶的能力尤其重要,制曲发酵过程中酱醪的酶活直接影响原料利用率、发酵周期[2-3],决定了黄豆酱的品质。

研究发现,在传统黄豆酱制作过程中微生物种类丰富,其中米曲霉、黑曲霉为主要作用霉菌[4-6]。在现代人工接种发酵中,采用单菌种制曲发酵、曲料混合发酵、多菌种混合制曲发酵、新型菌种制曲发酵等多种制曲发酵方法[7-13],黄豆酱呈现品质不均衡。曲料混合发酵是将单菌种成曲混合后发酵,多菌种混合制曲发酵则是多菌种混合后接种制曲直接进行发酵。枯草芽孢杆菌属于益生菌,对人体动植物有益无害,由于其高蛋白酶活性被广泛制作于酶制剂[14-15],在日本、韩国还用于制作纳豆和韩国豆酱,但在中国传统发酵豆制食品制作中应用较少[16-19]。

本实验选取人工接种常用霉菌米曲霉、黑曲霉、甘薯曲霉、毛霉、红曲霉、米根霉和工业常用微生物枯草芽孢杆菌为主要接种微生物,通过单菌种、2菌种、3菌种、4菌种、5菌种、6菌种和7菌种混合,研究单菌种制曲发酵、曲料混合发酵和多菌种混合制曲发酵三种发酵方式对酱醪中蛋白酶活力和氨基酸态氮含量的影响,得到菌种最佳组合和最佳接种方式,进一步优化黄豆酱生产工艺和提高黄豆酱品质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑龙江黄豆 市售;酪氨酸、福林酚试剂(Folin试剂)、三氯乙酸、可溶性淀粉、DNS试剂、碘化钾、硫代硫酸钠等均为分析纯、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基 成都科龙有限责任公司;沪酿3.042米曲霉、AS 3.35黑曲霉、AS 3.324甘薯曲霉、沪酿3.130毛霉、AS 3.972红曲霉 上海迪发酿造生物制品有限公司;米根霉、枯草芽孢杆菌 实验室保藏菌种[20]。

UV-2600型紫外可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;LD5-10低速离心机 北京医用离心机厂;HXD-60J高压蒸锅 中山市奥尼亚电器有限公司;KXB-12AN恒温培养箱 成都科析仪器成套公司;HWS-150恒温恒湿培养箱 北京中兴公司;HSQ-I恒温水浴锅 上海智城分析仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄豆酱制曲、发酵工艺

浸泡:将颗粒饱满无虫害的黄豆洗净,放入容器内浸泡,黄豆与水质量比为1∶3,浸泡8 h左右沥干备用。蒸煮:浸泡后的黄豆高压蒸锅蒸煮25 min,将其冷却到50 ℃。混合:冷却后的黄豆与面粉混合,黄豆与面粉质量比为1∶3.5。接种:待黄豆和面粉混合物温度冷却到40 ℃时接种菌种,接种量为1 mL/100 g大豆混合物,菌种浓度调整为106cfu/mL。成曲:曲料放入恒温恒湿培养箱,调节温度为30 ℃、湿度60%,沪酿3.042米曲霉、AS 3.324甘薯曲霉、沪酿3.130毛霉、AS 3.972红曲霉、米根霉和枯草芽孢杆菌制曲72 h,AS 3.35黑曲霉制曲48 h。发酵:将成曲与14%浓度盐水按照质量比1∶1混合,放入恒温恒湿培养箱,调节温度40 ℃、湿度60%。

1.2.2 制曲过程中各菌种产酶活性的研究 黄豆和面粉混合物分别接种7种菌种,在制曲过程中每隔12 h测定黄豆曲中蛋白酶活力、淀粉酶活力和糖化酶活力,研究各菌种在制曲过程中的酶活表现。

1.2.3 菌种接种方式的研究 单菌种制曲发酵:黄豆和面粉混合物分别接种7种菌种,将成曲按照表1中单菌种序号进行标号,发酵7 d后测定酱醪中蛋白酶活力和氨基酸态氮含量。

曲料混合发酵:黄豆和面粉混合物分别接种7种菌种,将成曲按照表1中2菌种、3菌种、4菌种、5菌种、6菌种和7菌种组合混合(每种成曲混合比例均等)且标号,发酵7 d后测定酱醪中蛋白酶活力和氨基酸态氮含量。

多菌种混合制曲发酵:菌种按照表1中2菌种、3菌种、4菌种、5菌种、6菌种和7菌种组合制备菌种混合液(每种菌种混合比例均等),黄豆和面粉混合物接种菌种混合液制作成曲,发酵7 d后测定酱醪中蛋白酶活力和氨基酸态氮含量。

表1 菌种复合一览表Table 1 Lists of compound strains

1.2.4 蛋白酶活力的测定

1.2.4.1 标准曲线的绘制 根据GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂》[21]进行测定。蛋白酶活力指在40 ℃,pH7.2条件下,1 mL发酵水提液在1 min内水解酪蛋白产生l μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位U(U/mL)。

向试管中分别加入浓度为0、20、40、60、80和100 μg/mL酪氨酸溶液1 mL(3个平行),接着加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5 mL和稀释福林酚试剂1 mL(稀释福林酚试剂:加2倍蒸馏水稀释),摇匀后置于40 ℃保温发色20 min,在660 nm波长下测定OD值,测定3次取其平均值,蒸馏水做空白样。以净OD值为纵坐标,酪氨酸浓度为横坐标,绘制标准曲线,标准曲线为:

y=0.0080x+0.0078(R2=0.9987)

1.2.4.2 实际样品的测定 称取5 g酱曲(3个平行),加入蒸馏水定容至100 mL,40 ℃下100 r/min水浴浸提1 h,4000 r/min离心20 min,取上清液,用0.1 mol/L的pH7.2磷酸缓冲液稀释2倍,即制作成粗酶液。试管内加入1 mL粗酶液,40 ℃水浴预热2 min后加入1 mL的酪蛋白溶液(先40 ℃水浴预热),精确保温10 min后立即加入0.4 mo1/L三氯乙酸2 mL,终止反应,继续置于水浴锅中保温20 min,使残余蛋白质完全沉淀后,离心取其上清液备用。额外向试管中加入滤液1 mL、0.4 mo1/L碳酸钠5 mL、稀释后福林试剂1 mL,摇匀后于40 ℃水浴保温发色20 min,在660 nm处进行测定其吸光值OD。空白试验为先加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL保温10 min后再加入1 mL酪蛋白溶液继续保温20 min,与样品测定中三氯乙酸和酪蛋白溶液的添加顺序相反。

式中:X表示样品蛋白酶活力,U/mL;A表示由样品测得OD660 nm值,由标准曲线查得的相当于酪氨酸数;4表示4 mL反应液取出1 mL测定;N表示样品稀释的倍数;10表示代表反应时间为10 min;W表示样品水分含量。

1.2.5 淀粉酶活力的测定 参考赵晓娟[22]在制作苦荞纳豆酱中的淀粉酶活力测定方法。淀粉酶活力指1 g固体样品于40 ℃,pH6.0条件下,1 min内催化水解可溶性淀粉产生1 mg还原糖的酶量定义为一个淀粉酶活力单位U(U/mL)。

取充分研细的酱曲1 g,加入质量分数为0.2%的CaCl2溶液100 mL,于40 ℃水浴1 h,充分搅拌,过滤得到样液。在烧杯中加入1 mL样液和pH6.0磷酸盐缓冲液1 mL,40 ℃水浴10 min,然后加入2%的可溶性淀粉溶液1 mL,反应5 min后立即加入0.4 mol/L氢氧化钠溶液4 mL。吸取上述溶液1 mL,加入DNS试剂1 mL,沸水浴5 min进行还原反应,显色后迅速冷却,定容于15 mL,于540 nm处测定吸光值OD。以蒸馏水替代样液进行空白测定。

式中:X表示样品淀粉酶活力,U/mL;A表示净吸光度(样品与空白吸光度之差);8表示样液共8 mL;W表示样品水分含量。

1.2.6 糖化酶活力的测定 根据GB 1886.174-2016《食品添加剂 食品工业用酶制剂》[23]进行测定。糖化酶活力指1.0 g固态发酵产物在40 ℃、pH4.6条件下,1 h分解可溶性淀粉产生1.0 mg葡萄糖,即为1个酶活力单位,U/g。

粗酶液制备:称取5.0 g酱曲,加90 mL水和10 mL pH4.6乙酸—乙酸钠缓冲液,摇匀,40 ℃恒温水浴1 h,每隔l0 min左右震荡一次。用四层纱布过滤,滤液稀释到适当倍数测定。

样品测定:取A、B两个容量品,分别加入2%可溶性淀粉溶液25 mL和pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液5 mL,充分摇匀,在40 ℃水浴锅中预热5 min。在A管中加入粗酶液2 mL,B管加入200 g/L氢氧化钠溶液0.2 mL,摇匀,在此温度下准确反应30 min后,立即向A管中加入200 g/L氢氧化钠溶液0.2 mL,向B管中补充粗酶液2 mL,摇匀,迅速冷却。吸取A、B管中的反应液和空白液5 mL于100 mL烧杯中,准确加入0.1 mol/L碘溶液10 mL,再加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液15 mL,摇匀,并于暗处放置反应15 min,取出,加入2 mo1/L硫酸溶液2 mL,用0.05 mo1/L的硫代硫酸钠溶液滴定至刚好无色。

式中:X表示样品的糖化酶活力,U/mL;VB表示空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积,mL;VA表示样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积,mL;c表示硫代硫酸钠溶液的浓度,mol/L;90.05表示与1.00 mL硫代硫酸钠溶液相当的以克表示的葡萄糖的质量;32.2表示反应液总体积,mL;5表示吸取反应液的体积,mL;1/2表示吸取滤液2.00 mL,以1.00 mL计;n表示稀释倍数;2表示反应30 min,换算成1 h的酶活力系数。

1.2.7 氨基酸态氮含量测定 根据GB 5009.235-2016《食品中氨基酸态氮的测定》[24]进行测定。

1.3 数据处理

实验平行组为3组,采用SPSS 18.0软件进行数据处理和分析,采用Origin 9.0软件进行数据图的制作。

2 结果与分析

2.1 制曲过程中各菌种产酶活性的变化

由图1可以看出,酶活总体变化趋势随着制曲时间的增加逐渐增高,在制曲72 h后上升趋势变缓或者有下降趋势,与菌种在培养基中产酶变化一致,7种菌种在制曲环境中适应性强,菌种种类不同产酶活性差异较大。蛋白酶活力在制曲36 h后上升趋势明显,72 h后上升趋势减缓,在制曲72 h时,沪酿3.042米曲霉产蛋白酶活力(1470 U/mL)和枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力(892 U/mL)较高;各菌种产淀粉酶活力差异较大,AS 3.324甘薯曲霉和AS 3.35黑曲霉产酶活性上升趋势明显,在72 h后趋于平稳,最高分别可达857和784 U/mL;AS 3.35黑曲霉产糖化酶活性最突出,在48 h后上升趋势变缓,最高可达1486 U/mL。在制曲过程中,黄豆和面粉为微生物分解的主要原料,其中大豆蛋白质含量最多,蛋白酶可将其水解成低分子蛋白胨、多肽及氨基酸等,为后续酱醪的发酵提供了充足的碳源、氮源,也使得黄豆酱含有种类丰富的氨基酸,促进其营养丰富、味道鲜美。因此,蛋白酶作用对大豆蛋白质分解至关重要,增加蛋白酶活力更有利于黄豆酱品质的保证。

图1 制曲过程中酶活的变化Fig.1 Changes in enzyme activity during koji-making

2.2 单菌种制曲发酵对黄豆酱品质的影响

黄豆在发酵过程中,蛋白类物质水解产生游离氨基酸,氨基酸是重要的呈味物质,与黄豆酱特殊风味的生成有密切关系,是能够决定黄豆酱品质的重要因素,氨基酸含量越高黄豆酱滋味越浓郁。游离氨基酸的含量可由氨基酸态氮含量表示,能够反映出黄豆酱发酵成熟度[25-26]。成曲添加14%的盐水按料液比1∶1混合,40 ℃发酵7 d后,酱醪中蛋白酶活力较成曲有所下降,在盐水的作用下,微生物生长变缓,菌种产酶能力下降,酶活降低,发酵环境pH逐渐降低,中性蛋白酶活力降低,总体蛋白酶活力降低,其中沪酿3.042米曲霉蛋白酶活力最高(580 U/mL)。发酵7 d后酱醪中氨基酸态氮含量均超过GB/T 24399-2009《黄豆酱》[27]规定标准0.5 g/100 g,此时酱醪中肽类物质被充分分解为氨基酸,可保证酱醪中呈味物质的含量,其中沪酿3.042米曲霉酱醪中氨基酸态氮含量最高(0.85 g/100 g)。

2.3 曲料混合发酵对黄豆酱品质的影响

黄豆酱成曲按照表1混合后发酵7 d,测定其蛋白酶活力和氨基酸态氮含量。由图3可知,2菌种和3菌种混合时较其它组合混合产生的蛋白酶活力平均值较高,超过单菌种最大酶活(米曲霉产蛋白酶活力580 U/mL)的组合数多,不同成曲的混合对黄豆酱发酵过程中产蛋白酶活力影响较大。在2菌种曲料混合发酵中,超过单菌种最大酶活的组合占2菌种总数的33.3%,其中17号酶活最高(662 U/mL);在3菌种曲料混合发酵中,超过单菌种最大酶活组合占3菌种总数的85.7%,其中5号蛋白酶活力(793 U/mL)最高,贡汉坤[28]在研究传统豆酱发酵工艺时发现米曲霉、酱油曲霉、黑曲霉分开制曲后混合发酵得到的酱醪酶系丰富,3菌种成曲混合发酵增加了酶活力。在4菌种曲料混合发酵中,超过单菌种最大酶活的组合占4菌种总数的20%,其中5号蛋白酶活力最高(700 U/mL);5菌种、6菌种和7菌种蛋白酶活力效果不显著,均低于单菌种最大酶活。

图3 曲料混合发酵对蛋白酶活力的影响Fig.3 Effects of mixed koji cultures on protease activity

从图4可知,酱醪在发酵7 d后氨基酸态氮含量基本超过国家标准(0.5 g/100 g),2菌种和3菌种混合对氨基酸态氮含量影响最明显,氨基酸态氮含量平均值较高且超过单菌种最大氨基酸态氮含量(米曲霉产氨基酸态氮含量0.75 g/100 g)的组合数多,4菌种、5菌种、6菌种和7菌种氨基酸态氮含量平均值较低。在2菌种曲料混合发酵中,超过单菌种最大氨基酸态氮含量的组合占2菌种总数的57.1%,其中5号含量最高(0.94 g/100 g);在3菌种曲料混合发酵中,超过单菌种最大氨基酸态氮含量的组合占3菌种总数的94.3%,其中4号(1.21 g/100 g)和5号(1.05 g/100 g)均超过1.0 g/100 g,米曲霉和黑曲霉复合有利于氨基酸态氮的生成,由于米曲霉产中性蛋白酶分解蛋白质为肽类,黑曲霉产酸性蛋白酶分解肽类为氨基酸,两者复合促进黄豆酱品质的提升。在4菌种曲料混合发酵中,超过单菌种最大氨基酸态氮含量组合占比为22.9%,其中4号氨基酸态氮含量最高(0.81 g/100 g);5菌种、6菌种和7菌种基本未超过单菌种最大氨基酸态氮含量。由此可见,混合的菌种数对曲料混合发酵中蛋白酶活力和氨基酸态氮含量的影响显著,菌种数越多对蛋白酶活力和氨基酸态氮含量的产生有一定的抑制作用,菌种数在3种组合时能最大效果促进产生蛋白酶活力和氨基酸态氮含量。

图4 曲料混合发酵对氨基酸态氮含量的影响Fig.4 Effects of mixed koji cultures on amino nitrogen content

2.4 多菌种混合制曲发酵对黄豆酱品质的影响

由图5可知,2菌种和3菌种混合时较其它组合混合产生的蛋白酶活力平均值较高且超过单菌种最大酶活的组合数多,4菌种、5菌种、6菌种和7菌种均未超过单菌种最大酶活,菌种混合制曲时,菌种间的拮抗作用阻碍了菌种的生长,导致酱醪中酶系的不均衡和酶活偏低现象。在2菌种混合制曲发酵中,14.3%组合超过单菌种最大酶活,其中1号酶活最高(667 U/mL),李志江等[29]对比研究单一米曲霉制曲和米曲霉、黑曲霉混合菌液制曲,双菌种制曲提高了豆酱中酶系的活性,但缺少其他微生物菌种组合制曲对酶活的影响;在3菌种混合制曲发酵中,25.7%组合超过单菌种最大酶活,其中5号(713 U/mL)蛋白酶活力较高,林汲等[30]在研究米曲霉、黑曲霉、甘薯曲霉复合菌制曲发酵得到的成曲液化力以及蛋白活力有所提高,3菌种混合产酶效果明显。4菌种、5菌种、6菌种和7菌种产蛋白酶活力不显著,均低于单菌种最大酶活。

图5 多菌种混合制曲发酵对蛋白酶活力的影响Fig.5 Effects of koji containingmixed strains on protease activity

从图6可知,酱醪在发酵7 d后氨基酸态氮含量基本超过国家标准(0.5 g/100 g),2菌种和3菌种混合对氨基酸态氮含量影响最明显,氨基酸态氮含量平均值较高且超过单菌种最大氨基酸态氮含量的组合数多,4菌种、5菌种、6菌种和7菌种平均值较低且均低于单菌种最大氨基酸态氮含量。在2菌种混合制曲发酵中,14.3%组合超过单菌种最大氨基酸态氮含量,其中2号含量最高(0.80 g/100 g);在3菌种混合制曲发酵中,28.6%组合超过单菌种最大氨基酸态氮含量,其中 5号(0.89 g/100 g)含量最高。

图6 多菌种混合制曲发酵对氨基酸态氮含量的影响Fig.6 Effects of koji containing mixedstrains on amino nitrogen content

通过图2～图6的对比分析,单菌种制曲发酵、曲料混合发酵和多菌种混合制曲发酵三种发酵方式中,单菌种制曲发酵由于酶系的单一性和较低的酶活,酱醪中蛋白酶活力和氨基酸态氮含量较低;曲料混合发酵从蛋白酶活力和氨基酸态氮含量平均值以及超过单菌种最高值的组数来看,显著优于多菌种混合制曲发酵,与制曲过程中微生物的协同作用和酱醪中酶系叠加作用相关联,多菌种混合制曲发酵中由于多菌种间的不和谐生长和环境变化引起的反馈,造成微生物产酶能力和酶活作用受阻,导致蛋白酶活力和氨基酸态氮含量较低。

曲料混合发酵和多菌种混合制曲发酵做进一步对比,两种发酵方式中2菌种和3菌种蛋白酶活力和氨基酸态氮含量平均值以及超过单菌种最高值的组数较多,3菌种组合最为突出,其中5号(沪酿3.042米曲霉、AS 3.35黑曲霉和枯草芽孢杆菌)产蛋白酶活力和氨基酸态氮含量最佳,米曲霉产蛋白酶活力最高,枯草芽孢杆菌以分泌蛋白酶为主,可将蛋白质分解为多肽类物质,黑曲霉可分泌的酸性蛋白酶将多肽分解为氨基酸促进氨基酸态氮含量的提高。

3 结论

对比单菌种制曲发酵、曲料混合发酵和多菌种混合制曲发酵,多菌种较单菌种制作黄豆酱优越性更突出,其中曲料混合发酵更适宜用于黄豆酱的生产。当曲料混合发酵采用3菌种5号组合沪酿3.042米曲霉、AS 3.35黑曲霉和枯草芽孢杆菌成曲按照1∶1∶1比例混合后,与14%浓度盐水按质量比1∶1混合,在温度40 ℃、湿度60%环境下发酵7 d后可得到蛋白酶活力为793 U/mL、氨基酸态氮含量为1.05 g/100 g的黄豆酱酱醪,高蛋白酶活力和高氨基酸态氮含量是生产优质黄豆酱的重要基础。枯草芽孢杆菌运用于黄豆酱制曲发酵过程中,表现出较高的蛋白酶活力,利于制作高质量黄豆酱,但枯草芽孢杆菌在后期发酵阶段作用还需进一步研究。比较多种菌种接种方式对黄豆酱发酵的影响,提高酱醪中蛋白酶活力和氨基酸态氮含量,对进一步改进黄豆酱生产工艺、提高黄豆酱品质有重要意义,为豆类发酵制品提供研究基础。