荸荠表面拮抗细菌的分离鉴定及其表面抑菌活性

张 巧,农建彪,农进焕,段振华,*

(1.贺州学院食品与生物工程学院,广西贺州 542899; 2.广西果蔬保鲜和深加工研究人才小高地,广西贺州 542899)

荸荠(Eleocharisdulcis(Burm.f.)Trin. ex Hensch.)又名马蹄、地栗、红慈姑等,是一种果蔬兼用型的经济作物,主要分布于广西等地区。荸荠果肉鲜嫩质白,汁多爽脆,且营养丰富,有“地下雪梨”、“江南人参”的美誉[1-2]。但荸荠表面容易滋生腐败微生物,鲜果荸荠储藏期较短,严重影响荸荠的销售及深加工。荸荠的贮藏保鲜方法多种多样,传统方法有地窖贮藏、堆藏法、细沙贮藏、溶液贮藏等[3],这些贮藏方法效果显著,操作简便且成本低廉,但方式粗放,不适合远销和高端销售,已不能满足现代荸荠产业的发展需求。以鲜切荸荠为主的初级加工产品,主要采用涂膜保鲜、热处理、护色剂、氮气保鲜等现代贮藏保鲜技术[4-7],成本较高,操作复杂,且对荸荠的安全品质有一定的影响。目前,对于大面积种植荸荠的农户而言,仍采用传统的泥土堆藏法。因此,安全、高效、无害的果蔬保鲜技术是荸荠保鲜的迫切需求。

生物防治是指利用微生物之间的拮抗作用来防治病原菌的一种方法。拮抗菌在果蔬采后病害防治方面发挥重要的作用,如地衣芽孢杆菌对芒果炭疽病有较好的防治,汉森酵母和梅奇酵母能有效抑制苹果、油桃上霉菌的生长[8-10]。荸荠的腐烂与微生物活动息息相关,在贮藏过程中,其表面微生物种类与数量是在不断变化的。在贮藏前期,由于荸荠水分含量高,利于细菌的生长。张巧等[11]从腐烂荸荠中分离出2株腐败细菌木糖氧化无色杆菌和产气肠杆菌。颜梅新等[12-13]研究荸荠腐烂病的主要病原真菌是棘孢木霉、尖孢镰孢霉、奇异根串珠霉等16种。前期实验发现,带泥荸荠在贮藏过程中的质量损失率及腐烂率明显低于洗净荸荠[14]。带泥荸荠表面泥土中的微生物及其在荸荠贮藏过程中发挥的作用,目前还未见相关研究。针对这一问题,本研究从荸荠表面泥土中分离出一些拮抗细菌,并探究其对荸荠表面微生物的影响,为荸荠贮藏过程中新型生物贮藏保鲜技术的开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荸荠 广西贺州农户;营养琼脂培养基(NA)、平板技数琼脂培养基(PCA)、孟加拉红培养基 广州环凯生物技术有限公司;2×Taq PCR MasterMix、细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司;一次性针头式过滤器(0.22 μm,13 mm,水系) 天津市津腾实验设备有限公司;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 广东省微生物菌种保藏中心。

BSP-250型生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;SQ510C型立式压力蒸汽灭菌器 重庆雅玛拓科技有限公司;722N型可分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;5424R型高速冷冻离心机 Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 带泥荸荠表面泥土中细菌的分离 取新鲜的带泥荸荠,用一定量的无菌生理盐水将泥土洗入三角瓶中,30 ℃、180 r/min摇匀2 h,静置30 min,上层液体稀释至合适的浓度。将15～20 mL无菌的NA琼脂培养基倒入培养皿中,待其冷却后凝固,吸取1 mL稀释液至培养基表面,涂布均匀,37 ℃培养36 h,观察细菌的生长情况。从上述培养皿中挑出菌落形态不一的单菌落50株,转接至LB培养液中(酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L),37 ℃、200 r/min条件下培养24 h。取菌液划线于NA琼脂培养基中,获得单菌落,如此重复3次,获得纯化菌株,并观察菌落形态,进行革兰氏染色[15]。

1.2.2 拮抗细菌的筛选

1.2.2.1 发酵滤液的制备 将方法1.2.1分离的50株细菌分别接种至LB培养液中,37 ℃、200 r/min条件下培养24 h,获得待试菌发酵液。将发酵液离心(4 ℃,10000 r/min,10 min),上清液在超净工作台中用0.22 μm的滤器过滤除菌,即为无菌的发酵滤液。

1.2.2.2 抑菌活性的测定 参照李亚辉等[16]的方法并稍作修改。以大肠杆菌作为革兰氏阴性菌测试菌,金黄色葡萄球菌作为革兰氏阳性菌测试菌,在3 mL已灭菌的LB液体培养基中,加入300 μL的上述无菌发酵滤液,对照组用等体积的无菌LB培养基代替,按照1%的接种量分别接种大肠杆菌菌液(OD600=1.5)和金黄色葡萄球菌菌液(OD600=1.0),摇匀后37 ℃、200 r/min条件下培养18 h,测定600 nm处的吸光度。细菌发酵滤液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用大小用抑菌率表示,按照如下公式进行计算。

抑菌率(%)=(A0-A1)/A0×100

式中:A0为对照组的吸光值;A1为实验组的吸光值。

1.2.3 将分离到的纯菌株在NA培养基中划线，培养皿置于37 ℃的恒温培养箱中倒置培养，每隔12 h观察培养皿中菌落的生长速度、颜色、大小、形状、透明度、边缘结构等。

1.2.4 生理生化特征 参照《常见细菌系统鉴定手册》[17]对具有抑菌活性的细菌进行生理生化特征的鉴定。

1.2.5 分子生物学鉴定 将分离到的纯菌株通过测定16S rDNA基因序列进行鉴定,具体参照潘晓倩等[18]的方法并稍作修改。纯菌株接种于LB培养液中并于37 ℃培养24 h,按照细菌试剂盒上的方法提取DNA,以提取的DNA作为模板,采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。

PCR反应体系:2×Taq PCR MasterMix 25 μL、ddH2O 21 μL、27F 1 μL、1492R 1 μL、DNA模板 2 μL。

PCR扩增程序:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性0.5 min,56 ℃退火0.5 min,72 ℃延伸1.5 min,进行33个循环后72 ℃延伸10 min。

1%琼脂糖凝胶电泳后,得到1500 bp左右的扩增产物委托青岛英派生物技术有限公司进行测序。将测得的序列结果与NCBI GenBank中序列进行比对,通过MEGA6.06软件构建系统发育树。

1.2.6 细菌发酵滤液对荸荠表面微生物的影响 按1.2.2.1的方法制备无菌发酵滤液。将新鲜荸荠贮藏在20 ℃、80% RH的环境中5 d,取荸荠皮10 g,切碎后加入90 mL的无菌生理盐水,30 ℃、180 r/min摇匀2 h,静置30 min,取上清液稀释一定倍数,吸取1 mL稀释液至无菌培养皿中。将灭菌后的PCA、孟加拉红琼脂培养基50 mL冷却至45～55 ℃,分别加入无菌发酵滤液10 mL,对照培养皿加入10 mL的无菌LB培养液,混匀后倒入培养皿中,充分摇匀,待其凝固后按照表1条件进行培养,观察培养皿中的菌落数。并将培养皿中的单菌落一一挑出,分别进行革兰氏染色,显微镜观察,确定培养皿中的球菌数、杆菌数、G+菌数、G-菌数,比较对照组和实验组PCA培养皿中细菌类群。

表1 微生物培养条件Table 1 Culture conditions of different microorganisms

1.3 数据处理

所有数据均为三次平行实验的平均值,采用Excel 2007对实验数据进行处理,Origin 8.0绘制趋势曲线图,SPSS 17.0进行方差分析和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌的筛选

病原微生物是引起果蔬腐烂的一个重要因素,利用拮抗菌进行生物防治具有环保、高效、经济的优势,在果蔬保鲜方面具有较广的应用前景[19]。从带泥荸荠表面泥土中分离出50株细菌,其中8株细菌(编号分别为WB12、WB20、WB22、WB38、WB39、WB41、WB46、WB47)的无菌滤液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用,抑菌率见图1所示。由图1可知,WB22、WB39对大肠杆菌的抑菌率分别为23.36%、36.32%,对金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为28.14%、20.37%。因此,菌株WB22、WB39对2株指示菌的抑制作用较强,具有拮抗菌的抗菌潜力。

图1 不同细菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率Fig.1 Inhibitory rate of different bacteriaon Escherichia coli and Staphylococcus aureus

2.2 拮抗细菌的鉴定

2.2.1 菌落形态特征 通过观察拮抗细菌WB22、WB39在固体培养基上的单菌落形态,以及革兰氏染色后的显微镜观察,结果见表2。WB22为一株阳性芽孢杆菌,WB39为一株阴性无芽孢杆菌。

表2 菌落特征及菌体形态Table 2 The bacterial colony characteristics and morphology

2.2.2 生理生化特征 菌株WB22和WB39的生理生化特征结果由表3可知。WB22具有氧化酶、接触酶活性,能水解淀粉、乳糖,V-P反应为阳性,不能产生H2S、吲哚。根据《常见细菌系统鉴定手册》[17],结合菌落菌体形态及革兰氏染色结果,WB22与芽孢杆菌的基本特性较为相似,初步判断其为芽孢杆菌属。而WB39具有氧化酶、接触酶活性,但不能水解淀粉、乳糖等,不能进行V-P反应,能还原硝酸盐,不产生H2S、吲哚,判定其为假单胞菌属。

表3 生理生化特征Table 3 Characteristics of physiology and biochemistry

2.2.3 16S rDNA鉴定 将菌株WB22和WB39的PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行纯度分析,电泳结果见图2。由图2可知,菌株WB22和WB39仅在1500 bp附近显示较强的电泳条带,两株拮抗细菌的16S rDNA均被成功扩增。

图2 WB22和WB39的16S rDNA PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoresis patterns of PCR amplificationproducts of WB22 and WB39 based on 16S rDNA

将菌株WB22和WB39的16S rDNA序列与相似度高的已知菌株序列进行比对,构建的系统发育树见图3所示。由图3可知,菌株WB22与Bacillusamyloliquefaciens的同源性最高,WB39与Pseudomonasgeniculata的同源性最高,序列相似度均大于99%。因此,WB22被鉴定为解淀粉芽孢杆菌,WB39被鉴定为弯曲假单胞菌。据报道,解淀粉芽孢杆菌是一种具有广谱抑菌活性的细菌,通过形成一些抑菌蛋白、脂肽类物质、聚酮化合物等抑菌物质,能有效地抑制细菌、真菌等腐败微生物。因其具有抑菌谱广、安全无污染、不产生抗药性等优点,在果蔬采后保鲜方面有着较好的应用前景[20]。蒋凯丽等[21]从樱桃番茄果熟果中分离到一株解淀粉芽孢杆菌,对番茄采后常见病原菌抑制效果较好。假单胞菌能够产生较多的活性物质,比如细菌素、抗生素、嗜铁螯合物等,在生物防治上已有较多应用[22]。Kumar等[23]分离出一株能产生抗生素的假单胞菌,对多种植物病原菌起着抑制作用;张美琴等[24]从土壤中分离的一株具有开发潜力的假单胞菌,其对马铃薯晚疫疫霉菌的拮抗率高达89%。

图3 WB22和WB39的16S rDNA系统发育树Fig.3 Phylogenic trees of WB22 and WB39 based on their 16S rDNA

2.3 拮抗细菌对荸荠表面微生物的影响

在培养基中分别添加一定量的B.amyloliquefaciens和P.geniculata发酵滤液,培养皿中生长的菌落数越少,说明抑菌效果越好。由图4可知,对照组培养皿中的细菌数为4.88 lg(CFU/mL),分别添加B.amyloliquefaciens和P.geniculata发酵滤液的培养皿,细菌数分别为4.03和3.89 lg(CFU/mL),说明2株拮抗细菌的发酵滤液对荸荠表面细菌有抑制作用,且P.geniculata的抑制作用强于B.amyloliquefaciens;对照组培养皿中的酵母菌数为4.31 lg(CFU/mL),分别添加B.amyloliquefaciens和P.geniculata发酵滤液的培养皿,酵母菌数分别为3.95和4.11 lg(CFU/mL),荸荠表面的酵母菌受到一定的抑制作用,B.amyloliquefaciens的抑制作用强于P.geniculata;对照组培养皿中的霉菌数为3.78 lg(CFU/mL),分别添加B.amyloliquefaciens和P.geniculata发酵滤液的培养皿,霉菌数分别为3.26 lg和3.17 lg(CFU/mL),荸荠表面霉菌的生长被抑制,且P.geniculata的抑制作用强于B.amyloliquefaciens。经数据统计分析,B.amyloliquefaciens对荸荠表面细菌、酵母菌、霉菌的抑菌率分别为17.42%、9.05%和13.74%;P.geniculata对荸荠表面细菌、酵母菌、霉菌的抑菌率分别为20.29%、4.64%和16.14%。2株拮抗细菌发酵滤液对荸荠表面细菌、霉菌具有显著的抑制作用(P<0.05),且对细菌的抑制作用最强,对酵母菌的抑制作用不明显(P>0.05)。

图4 WB22和WB39对荸荠表面微生物数的影响Fig.4 Effects of WB22 and WB39 on the microbial counts ofEleocharis dulcis(Burm.f.)Trin. ex Hensch. surface 注:同类微生物柱形图上的不同字母表示差异显著(P<0.05)。

前期研究也表明,造成荸荠腐烂的主要病原微生物是霉菌和细菌[11-13]。因此,2株拮抗菌在荸荠采后的生物防治方面有较好的应用价值。

2株拮抗细菌对荸荠表面细菌不同类群(球菌、杆菌数,G+菌、G-菌)的影响结果见表4。由表4可知,对照组的球菌数和杆菌数分别为1.56和3.32 lg(CFU/mL),分别占细菌总数的31.97%、68.03%,G+菌和G-菌数分别为2.01和2.87 lg(CFU/mL),分别占比41.19%、58.81%。与对照组相比,添加B.amyloliquefaciens发酵滤液的培养皿中,球菌数和杆菌数分别为0.82和3.21 lg(CFU/mL),占比分别为20.35%和79.65%,G+菌和G-菌分别为1.32和2.71 lg(CFU/mL),占比分别为32.75%和67.25%。B.amyloliquefaciens发酵滤液使得培养皿中的球菌和G+数下降较多,杆菌和G-下降较少,说明其主要抑制的细菌是球菌和G+菌。添加P.geniculata发酵滤液的培养皿中,球菌数和杆菌数分别为1.31和2.58 lg(CFU/mL),占比分别为33.68%和66.32%,G+菌和G-菌分别为1.43和2.46 lg(CFU/mL),占比分别为36.76%、63.24%。因此,添加P.geniculata发酵滤液的培养皿中,球菌、杆菌、G+菌、G-菌数明显下降,但占比变化不大,说明P.geniculata发酵滤液抑菌范围较广,对杆菌和球菌、G+菌和的抑制作用均较强。拮抗菌对不同种类的细菌表现出不一样的抑菌效果,这在其他研究也有发现,郝彦利[25]从海水中分离一株枯草芽孢杆菌,其对G+菌的抑菌效果同样强于G-菌。陈帮丹等[26]研究一株粪肠碱杆菌的发酵液对部分临床G-菌有抑制作用,但是不能抑制临床G+菌。

表4 WB22和WB39发酵滤液抑制细菌的类别分析Table 4 Species of bacteria inhibited by the fermented filtrates of WB22 and WB39

3 结论

从带泥荸荠表面泥土中分离筛选得到2株拮抗细菌WB22、WB39,经菌体形态、生理生化特征及16S rDNA基因序列分析,确定WB22为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens),WB39为弯曲假单胞菌(P.geniculata)。目前对荸荠的生物防治研究还较少,本研究分离到的WB22、WB39对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用,作为拮抗菌在荸荠的生物保鲜方面具有一定的开发前景。

2株细菌发酵滤液对荸荠表面微生物具有一定的抑制作用,其中B.amyloliquefaciens发酵滤液对荸荠表面细菌、酵母菌、霉菌的抑菌率分别为17.42%、9.05%和13.74%,P.geniculata对荸荠表面细菌、酵母菌、霉菌的抑菌率分别为20.29%、4.64%和16.14%,说明B.amyloliquefaciens与P.geniculata在生长过程中,形成了某些抑菌物质,从而抑制着荸荠表面微生物的生长。且B.amyloliquefaciens主要抑制的细菌是球菌和G+菌,而P.geniculata发酵滤液的抑菌范围较广,对杆菌和球菌、G+菌和G-菌均具有较好的抑制作用。本研究为2株拮抗菌的实际应用及抑菌机理的探究提供了理论参考。