草莓多糖树脂法脱色工艺优化及其化学性质研究

刘 伟,刘倩楠,张 良,胡宏海,*,宋 弋

(1.中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193; 2.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083)

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是以血糖水平升高为特征的代谢性疾病,长期餐后高血糖状态可引起冠心病、肾病、视网膜病变等并发症。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶在人体中主要参与食物中碳水化合物消化吸收,抑制其活性可以延缓葡萄糖释放,抑制餐后血糖水平升高。目前,市面上α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制剂主要有伏格列波糖、米格列醇和阿卡波糖等,但是服用后容易引起胃肠道功能紊乱等不良反应。多糖是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物,广泛存在于动物、植物和微生物细胞壁,具有抗氧化、免疫调控、降血糖等生物活性[1-7]。因此,以功能性多糖为原料开发天然α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制剂具有广阔的市场需求和发展潜力。

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)果实色泽鲜红、酸甜可口、香气浓郁、软嫩多汁、营养丰富,深受广大消费者喜爱。相关研究表明草莓具有抗氧化、抗炎、抗肥胖、抗癌、抗细胞凋亡、抗高血压、抑制心血管疾病、抑制神经变性等生物活性和生理功能,主要与抗氧化成分如多酚、花青素、鞣花酸、阿魏酸、叶酸、VC等相关[8-16]。Liu等[17]发现草莓多糖(strawberry polysaccharides,SP)可显著提高脂多糖诱导小鼠巨噬细胞产生Bcl-2蛋白的表达水平,同时SP通过上调抗炎因子(IL-10)、下调促炎因子(白介素(IL)-1b和IL-6)发挥良好的抗炎活性,表明SP具有潜在开发利用价值。但是,草莓多糖降血糖活性的相关研究未见报道。

草莓多糖混有色素,不仅影响其外观品质,而且不利于多糖分离纯化、结构鉴定与构效关系研究。目前,多糖脱色的方法主要有活性炭法、双氧水法和透析法等,活性炭脱色和透析法处理时间长、多糖损失量大;过氧化氢脱色容易造成多糖水解,生物活性降低,不适于食品级多糖加工利用。大孔树脂是一类人工合成、具有多孔立体结构的聚合物,具有比表面积大、色素吸附能力强、方便操作、易再生等特点。近年来,大孔树脂广泛应用于猴头菌、龙眼、熟地、香椿等不同植物多糖脱色[18-21],显示了较好的脱色效果和较高的多糖保留率。本文比较了ADS-17、DA201、X-5、AB-8、D101、NKA-9等12种不同极性大孔吸附树脂对草莓多糖脱色作用,筛选、优化大孔树脂的最佳脱色工艺参数,对草莓多糖的化学成分、单糖组成、分子量、光谱特性、抗氧化活性以及α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜草莓(品种:红颜) 北京美廉美超市;无水乙醇、氢氧化钠、磷酸氢钠等 均为国产分析纯,国药集团化学试剂北京有限公司;大孔树脂的种类和物理性质如表1所示 北京索莱宝科技有限公司;总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)、总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法) 碧云天生物技术有限公司;总蛋白测定试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司;单糖和糖醛酸标样、对硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷(pPNG)、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶源叶生物、猪胰α-淀粉酶等 美国Sigma公司。

表1 大孔树脂的物理性质Table 1 Physical properties of the macroporous resins

Wyatt Technology DAWN EOS多角度激光光散射仪 美国怀雅特技术公司;DIONEX ICS-3000离子色谱 美国戴安公司;SIGMA 3K-15高速冷冻离心机 德国SIGMA公司;FTIR 7000傅里叶红外光谱仪 美国瓦里安公司;RE-3000型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;DNM-9606酶标分析仪 北京普朗新技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 草莓多糖制备 草莓去蒂,清洗,沥干,切成小块,冷冻干燥48 h,粉碎,过40目筛。取20 g草莓粉和200 mL的95%乙醇置于索氏提取器,80 ℃回流处理2次,每次4 h。回流处理后的草莓渣液过滤后置于通风厨通风处理48 h,真空包装,4 ℃冷藏备用。

取50 g经过回流处理的草莓粉,加入蒸馏水1500 mL,于80 ℃水浴浸提4 h,离心后收集上清液,残渣继续用蒸馏水(料液比1∶3 g/mL)于80 ℃水浴浸提3 h,离心后合并两次上清液,低压蒸发浓缩至200 mL后置于4 ℃冷藏备用。将无水乙醇以4∶1 (V∶V)比例浓缩后的上层溶液中(乙醇终浓度80%),边加边磁力搅拌30 min后,于4 ℃醇沉12 h,1000 r/min条件下离心20 min,收集沉淀,透析,冷冻真空干燥,Savage法去除蛋白,得到草莓多糖。

1.2.2 大孔树脂脱色条件优化

1.2.2.1 大孔树脂预处理及筛选 将大孔树脂(表1中的树脂类型)置于95%乙醇中浸泡24 h,然后用蒸馏水洗至无乙醇味;再用1 mol/L HCl溶液浸泡8 h,用蒸馏水洗至流出水pH为中性;然后用1 mol/L NaOH 溶液浸泡8 h,用蒸馏水洗至流出水pH为中性,60 ℃真空干燥0.5 h,4 ℃冷藏备用。配制5 mg/mL草莓多糖10 mL溶液,加入2 g经过预处理的大孔树脂。然后,120 r/min、25 ℃脱色12 h,测定不同大孔树脂对草莓多糖脱色率、保留率和选择系数的影响。

1.2.2.2 多糖浓度对NKA-9大孔树脂脱色效果的影响 配制不同初始浓度(5、10、20、30、40、50、70、80 mg/mL)草莓多糖,其他条件为多糖浓度30 mg/mL,时间60 min,pH8),比较静态脱色试验中多糖浓度对NKA-9大孔树脂多糖脱色率、保留率和选择系数的影响。

1.2.2.3 时间对NKA-9大孔树脂脱色效果的影响 配制30 mg/mL草莓多糖,在温度50 ℃,pH8,不同时间(5、10、20、30、40、50、60、70、80 min)时,比较静态脱色试验中NKA-9大孔树脂多糖脱色率、保留率和选择系数的影响。

1.2.2.4 温度对于NKA-9大孔树脂脱色效果的影响 配制30 mg/mL草莓多糖,在时间60 min,pH8,不同温度(25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃)时,比较静态脱色试验中NKA-9大孔树脂多糖脱色率、保留率和选择系数的影响。

1.2.2.5 pH对NKA-9大孔树脂脱色效果的影响 配制30 mg/mL草莓多糖,在时间60 min,温度50 ℃,不同pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)时,比较静态脱色试验中NKA-9大孔树脂多糖脱色率、保留率和选择系数的影响。

1.2.2.6 上样液体积和流速对NKA-9大孔树脂脱色效果的影响 根据上述静态吸附优化试验结果(多糖浓度30 mg/mL,时间60 min,温度50 ℃,pH8.0)进行动态吸附试验,称取20 g预处理的NKA-9大孔树脂湿法装柱(Φ 3 cm×35 cm),探究不同上样液体积(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h)及不同流速(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 BV/h)对NKA-9大孔树脂的泄漏曲线影响。

1.2.3 多糖脱色率测定 配制5 mg/mL草莓多糖10 mL溶液,加入2 g经过预处理的大孔树脂。然后,120 r/min、25 ℃脱色12 h,离心取上清,在420 nm测定草莓多糖溶液脱色前后的吸光值,并计算脱色率(%)见公式(1)[22]。

多糖脱色率(%)=(脱色前吸光值-脱色后吸光值)/脱色前吸光值×100

式(1)

1.2.4 多糖保留率的测定 草莓多糖脱色处理方法与1.2.3相同,490 nm测定苯酚硫酸显色后的草莓多糖溶液脱色前后的吸光值,并计算多糖保留率(%)见公式(2)[23]。

多糖保留率(%)=脱色后多糖含量/脱色前多糖含量×100

式(2)

1.2.5 大孔树脂选择系数测定 草莓多糖脱色处理方法与1.2.3相同,多糖对不同大孔树脂选择系数的测定见公式(3)[23]。

选择系数=[(脱色前吸光值-脱色后吸光值)/脱色后吸光值]/[(脱色前多糖含量-脱色后多糖含量)/脱色后多糖含量]

式(3)

1.2.6 紫外光谱分析 配制5 mg/mL草莓多糖,在350～850 nm波长扫描。

1.2.7 红外光谱分析 取5 mg草莓多糖样品与160 mg KBr混合、研磨、压片,在4000～400 cm-1下以32倍速度扫描,光谱的分辨率为4 cm-1。

1.2.8 化学成分分析 草莓多糖的总糖含量采用苯酚-硫酸法进行测定,以D-葡萄糖作为标准品[24];蛋白质含量用Lowry法进行测定,以牛血清蛋白为标准品[25];将草莓多糖配制成1 mg/mL溶液,以半乳糖醛酸为对照,采用硫酸-咔唑法[26],在523 nm波长处测定吸光度,绘制标准曲线并计算多糖DPB中糖醛酸的含量。

草莓多糖的单糖和糖醛酸组成和含量采用高效阴离子交换色谱(High performance anion exchange chromatography,HPAEC)[27]。取10 mg 草莓多糖样品,加入4 mol/L的三氟乙酸4 mL,充氮1 min排出管内空气,旋紧螺旋盖,于120 ℃水解2 h,待冷却后氮气吹干水解液,除去过量的三氟乙酸,加超纯水定容至5 mL。稀释后,过0.22 μm微孔滤膜,待HPLC进样分析。分别配制浓度为5 ppm的各单糖和糖醛酸标准品储备液,用去离子水稀释成不同浓度(0.01～5 ppm)的标准工作溶液,供离子色谱分析。HPAEC分析前4 ℃保存样品。

色谱条件:Carbo PacTMPA20 3×150 mm色谱柱;流动相:A为水,B为250 mmol/L的NaOH,C为1 mol/L的NaAc,0～20 min:94% A,6% B,0% C;20～20.1 min:89% A,6% B,5% C;20.1～35 min:74% A,6% B,20% C;35.1～45 min:20% A,80% B;45.1～55 min:94% A,6% B。流速:0.5 mL/min;进样体积:10 μL;柱温:35 ℃;检测器:脉冲安培检测器,金电极。

1.2.9 酯化度测定 配制0.5 mol/L NaOH溶液、0.5 mol/L HCl溶液、0.05 mol/L NaOH溶液、0.5%的酚酞指示剂。用除CO2水配制1 mg/mL的草莓多糖溶液,取20 mL,用0.05 mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至pH=8.1,记录所消耗氢氧化钠的毫升数V1即为原始滴定度。继续加入5 mL 0.5 mol/L的氢氧化钠溶液,加塞后强烈震荡15 min,加入0.5 mol/L盐酸溶液中和,振摇至粉红色消失为止。用0.05 mol/L氢氧化钠溶液再次滴定至pH=8.1,记录所消耗氢氧化钠的毫升数V2,即为酯化度见公式(4)[28]。

多糖的酯化度=V2/(V1+V2)

式(4)

1.2.10 分子质量测定 采用高效分子排阻色谱-多角度激光光散射检测器-示差折光检测器联用(High perfomance size exclusion chromatography-multi-angle laser light scattering detector-differential refraction detector,HPSEC-MALLS-RID)测定脱色后草莓多糖样品的分子质量。取草莓多糖样品2 mg,溶于2 mL质量分数0.9% NaCl溶液,过0.45 mm膜,进样。色谱柱:Shodex OHpak SB-806M HQ 300 mm×7.8 mm,13 mm);进样量200 μL;检测波长:658 nm;流动相:0.9% NaCl溶液;流速:0.5 mL/min。数据处理和分析采用激光光散射操作软件。

1.2.11 抗氧化活性测定

1.2.11.1 ABTS+·清除能力测定 草莓多糖对ABTS+·清除活力测定参照Re等[29]的方法并稍作修改,配置ABTS工作液:将溶解于50 mL磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)的ABTS(2 mmol/L)静置过夜作为储备液,与200 mL过硫酸钾溶液(70 mmol/L)反应获得ABTS+·阳离子。试验使用前,用磷酸盐缓冲溶液溶解使ABTS溶液在734 nm的OD值为0.700±0.030。采用蒸馏水依次配制0.15、0.30、0.60、0.90、1.20和1.50 mmol/L Trolox标准溶液,96孔板的每个检测孔中依次加入200 μL ABTS工作液,空白对照孔中加入10 μL蒸馏水,标准曲线检测孔中分别加入10 μL各种浓度的Trolox标准溶液,样品检测孔中分别加入2.5、5、10 mg/mL草莓多糖溶液10 μL,室温孵育5 min,在734 nm波长处测定吸光值,根据标准曲线并以Trolox标准溶液的浓度表示样品的抗氧化能力。

1.2.11.2 FRAP法抗氧化活性测定 草莓多糖FRAP法抗氧化活性测定参照Benzie等[30]的方法并稍作修改,配制FRAP工作液:0.3 mol/L醋酸缓冲溶(pH=3.6)、10 mmol/L 2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)盐酸溶液和20 mmol/L FeCl3,溶液按10∶1∶1体积比配制,采用蒸馏水依次配制0.15、0.30、0.60、0.90、1.20和1.50 mmol/L FeSO4标准溶液,96孔板的每个检测孔中依次加入180 μL FRAP工作液,空白对照孔中加入5 μL蒸馏水,标准曲线检测孔中分别加入5 μL各种浓度的FeSO4标准溶液,样品检测孔中分别加入2.5、5、10 mg/mL草莓多糖溶液5 μL,37 ℃孵育5 min,在593 nm波长处测定吸光值,根据标准曲线计算并以FeSO4标准溶液的浓度表示样品抗氧化能力。

1.2.12 降血糖活性测定

1.2.12.1α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 草莓多糖对α-葡萄糖苷酶体外抑制活性测定参照Chen等[31]的方法并稍作修改。50 μL不同浓度(0～20 mg/mL)草莓多糖溶液中分别加入100 μLα-葡萄糖苷酶(1 U/mL),37 ℃孵化10 min后加入50 μL对pPNG(5 mmol/L),然后37 ℃孵化20 min后加入100 μL Na2CO3溶液(1 M)终止酶解反应。在405 nm测定反应体系的吸光值变化,并计算草莓多糖溶液对α-葡萄糖苷酶体外抑制率(%)见公式(5)。

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[1-(样品吸光值-对照组1吸光值)/对照组2吸光值]×100

式(5)

式中:对照组1为pPNG和草莓多糖混合溶液(不含α-葡萄糖苷酶);对照组2为pPNG和α-葡萄糖苷酶混合溶液(不含草莓多糖)。

1.2.12.2α-淀粉酶抑制活性测定 草莓多糖对α-淀粉酶体外抑制活性测定参照Meng等[32]的方法并稍作修改。50 μL不同浓度(2.5、5.0、10.0 mg/mL)草莓多糖溶液中分别加入100 μLα-淀粉酶(1.0 U/mL),25 ℃孵化10 min后加入50 μL 1%(W/V)淀粉溶液,25 ℃孵化10 min后加入0.1 mL二硝基水杨酸(10 mg/mL)终止酶解反应,并在沸水浴中加热10 min。在540 nm测定反应体系的吸光值变化,并计算草莓多糖对α-淀粉酶体外抑制率(%)见公式(6)。

α-淀粉酶抑制率(%)=[1-(样品吸光值-对照组1吸光值)/对照组2吸光值]×100

式(6)

式中:对照组1为淀粉和草莓多糖混合溶液(不含α-淀粉酶);对照组2位淀粉和α-淀粉酶混合溶液(不含草莓多糖)。

1.2.12.3α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制动力学测定 脱色后草莓多糖对α-葡萄糖苷酶抑制动力学测定:取不同浓度草莓多糖(7.662、15.324 mg/mL),测定不同底物pPNG的浓度(0.75～6 mmol/L)条件下反应体系的反应速率,对照组为0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶,以(1/V)为纵坐标,以(1/S)为横坐标,绘制Lineweaver-Burk双倒数曲线,确定抑制类型。

1.2.12.4 脱色后草莓多糖对α-淀粉酶抑制动力学测定 取不同浓度草莓多糖(4.590、2.795 mg/mL),测定不同α-淀粉酶浓度(0.25%～1.25%)条件下反应体系的反应速率,对照组为1.0 U/mLα-淀粉酶,以(1/V)为纵坐标,以(1/S)为横坐标,绘制Lineweaver-Burk双倒数曲线,确定抑制类型。

1.3 数据处理

每个实验指标最少做三个平行试验,最后测定数据用SPASS 17.0进行分析,P<0.05为差异显著,统计值使用“平均值±标准差”表示。所得结果进一步用Origin 9.1做图表示。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂脱色条件优化

2.1.1 不同大孔树脂对草莓多糖脱色率、保留率和选择系数的影响 大孔树脂的吸附作用与其网状结构、比表面积、粒径、功能基团等有关[33]。图1比较了不同大孔树脂对草莓多糖脱色率、保留率和选择系数的影响,其中极性大孔树脂对于草莓多糖的脱色率显著高于其他类型大孔树脂,脱色率均超过70%;4种极性大孔树脂中NKA-9对于多糖的保留率最高,达到78%。因此,选择NKA-9大孔树脂用于后续试验。

图1 不同大孔树脂对草莓多糖脱色率、保留率和选择系数的影响Fig.1 Effects of different macroporous resins on decolorationratios,recovery ratios and selectivity coefficients of SP

2.1.2 多糖浓度对于NKA-9大孔树脂脱色作用的影响 图2A表明随着多糖浓度增加,脱色率逐渐减少,而保留率逐渐增加。大孔树脂对于色素的吸附能力与功能基团的数量成正比,当大孔树脂功能基团不变时,多糖浓度越低越利于色素吸附,但是也容易促使多糖吸附造成损失[34]。NKA-9大孔树脂的选择系数在多糖浓度为30 mg/mL时达到最高值,表明此时脱色效率最好。因此,选择草莓多糖的初始浓度为30 mg/mL用于后续试验。

图2 静态脱色试验中草莓多糖浓度、时间、温度和pH对于NKA-9大孔树脂多糖脱色率、保留率和选择系数的影响Fig.2 Effects of different SP concentration,time,temperature and pH on decoloration ratios,recovery ratiosand selectivity coefficients of NKA-9 resin in static decoloration experiments

2.1.3 时间对于NKA-9大孔树脂脱色作用的影响 图2B结果表明随着脱色时间延长,多糖脱色率逐渐增加,60 min达到动态平衡。但是,多糖保留率随着脱色时间增加而缓慢减少,可能部分多糖通过吸附作用逐渐进入到大孔树脂内部孔隙,60 min后多糖保留率的降低趋势显著增加(P<0.05)。NKA-9大孔树脂的选择系数呈现先增加后减少的趋势,60 min达到最大值,表明其脱色效率最高。因此,选择60 min用于后续试验。

2.1.4 温度对于NKA-9大孔树脂脱色作用的影响 图2C结果表明随着温度增加,多糖脱色率也逐渐增加,50 ℃左右达到动态平衡。超过50 ℃时多糖脱色率没有显著性变化(P>0.05),而多糖保留率随着温度增加而减少。多糖黏度随着温度增加而逐渐降低,从而导致色素分子更容易靠近、吸附在大孔树脂的表面和内部,多糖的吸附量也随着温度的增加而增加。NKA-9大孔树脂的选择系数在50 ℃达到最大值,表明其脱色效率最高。因此,选择50 ℃用于后续试验。

2.1.5 pH对于NKA-9大孔树脂脱色作用的影响 图2D表明随着pH增加,多糖脱色率也逐渐增加,pH8.0时达到动态平衡。在碱性溶液中多糖脱色率比中性或酸性溶液中更高,可能是由于色素苯环上的酚羟基在碱性环境中容易被解离为阴离子而吸附[35]。但是,多糖保留率随着pH增加而减少。NKA-9大孔树脂的选择系数在pH8.0达到最大值,表明其脱色效率最高。因此,选择pH8.0用于后续试验。

2.1.6 上样液体积和流速对于NKA-9大孔树脂脱色作用的影响 如图3所示,上样液流速越低,越有利于多糖色素与大孔树脂充分接触,提高多糖脱色率。随着上样液流速增加,多糖脱色率和保留率均降低,当上样液体积和流速分别为4.5 BV、3.0 BV/h时,选择系数达到最大值8.24±0.21,多糖脱色率和保留率分别为91.24%±1.32%和78.86%±1.21%。

图3 动态脱色试验中草莓多糖溶液对于NKA-9大孔树脂的泄漏曲线Fig.3 Dynamic decoloration leakage curves ofSP solution on NKA-9 resin

2.2 紫外光谱和红外光谱扫描分析

图4中紫外光谱扫描图表明草莓多糖色素的吸收峰350～850 nm,经过NKA-9大孔树脂脱色后吸收峰消失。样品图中暗红色的草莓多糖溶液经过脱色处理变为乳白色,表明草莓多糖色素被NKA-9大孔树脂充分吸附。红外光谱扫描图表明草莓多糖经过NKA-9大孔树脂脱色处理前后的特征吸收峰没有明显的差异。草莓多糖在3394.33 cm-1处为O-H伸缩振动的强吸收峰[36],在2933.35、1416.92 cm-1处为C-H的不对称伸缩振动和变角振动的吸收峰,为多糖类物质特征吸收峰[37]。在1610.89 cm-1处为酰胺基C=O的伸缩振动的吸收峰,1746.91 cm-1处为羧基的特征吸收峰。1021.44～1147.39 cm-1范围内为C-O-C和C-O-H的反对称伸缩振动峰,表明草莓多糖主要为吡喃糖结构。在1235.55 cm-1处为C-N和N-H伸缩振动的吸收峰,918.16 cm-1处为D-吡喃糖环非对称伸缩振动的特征吸收峰,在832.51 cm-1处的吸收峰表面草莓多糖主要以α-构型的糖苷键为主[38]。

图4 草莓多糖溶液脱色前后全波长扫描图谱(A)、红外光谱扫描图(B)及样品图Fig.4 UV-Vis spectrum(A),infrared spectrum(B)ofSP solution before and after decoloration

2.3 化学成分组成分析

如表2所示,脱色后草莓多糖中各组分含量分别为糖78.23%(w/w)、蛋白6.14%(w/w)、糖醛酸8.56%(w/w)、水分5.96%(w/w)。如图5A所示,6种单糖和2种糖醛酸PMP衍生物在离子色谱中得到较好的分离,混合标准液中各PMP衍生物的流出顺序及保留时间依次为岩藻糖2.90 min、鼠李糖4.88 min、阿拉伯糖5.40 min、半乳糖6.66 min、葡萄糖7.27 min、果糖9.52 min、半乳糖醛酸29.68 min、葡萄糖醛酸31.04 min。如图5B所示,草莓多糖中单糖的保留时间与标准品鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸的保留时间吻合,表明草莓多糖由这5种单糖和2种糖醛酸组成,物质的量比为1.00∶0.67∶0.69∶0.80∶0.65∶0.29∶0.69,由此推测草莓多糖为一种果胶类酸性杂多糖。通过滴定法测定草莓多糖的酯化度为DE=85.96%,为一种高甲氧基果胶多糖。

图5 单糖、醛酸标准品(A)和脱色后草莓多糖(B)的PMP衍生物离子色谱图Fig.5 Ion chromatogram of the PMP derivatives ofmonosaccharides,uronic acid standards(A)and SP(B)注:峰1:岩藻糖;峰2:鼠李糖;峰3:阿拉伯糖;峰4:半乳糖;峰5:葡萄糖;峰6:果糖;峰7:半乳糖醛酸;峰8:葡萄糖醛酸。

表2 脱色后草莓多糖化学成分组成Table 2 Chemical composition of SP

2.4 分子量测定

采用HPSEC-MALLS-RID联用测定脱色后草莓多糖分子质量,如图6所示,草莓多糖经过高效分子排阻色谱分离获得3个色谱峰,表明草莓多糖为非均一多糖。如表3所示,色谱峰Ⅰ(15.12 min)的相对含量为61.0239%,为草莓多糖主要成分,重均分子质量为393.9 kD。色谱峰Ⅱ(18.75 min)和色谱峰Ⅲ(19.94 min)的相对含量分别为17.4620%和21.5141%,重均分子质量分别为29.49、19.27 kD。

图6 脱色后草莓多糖高效分子排阻色谱Fig.6 HPSEC chromatogram of SP after decoloration

表3 脱色后草莓多糖分子质量及分布Table 3 Molecular weights and distributionof SP after decoloration

2.5 抗氧化活性测定

不同浓度草莓多糖对ABTS+·清除能力和FRAP法抗氧化活性测试结果分别如图7所示。图7A所示,以ABTS+·清除能力为例,随着草莓多糖质量浓度增加,其对于ABTS+·的清除能力逐渐提高,脱色前草莓多糖浓度从2.5 mg/mL上升至10 mg/mL时,抗氧化能力从0.15 Trolox mmol/L增加至0.79 Trolox mmol/L。草莓多糖经过NKA-9大孔树脂脱色处理后随着样液浓度的升高其抗氧化能力相应也呈线性上升趋势,但是,同样浓度条件下,脱色后的草莓多糖要比脱色前抗氧化能力显著减少,表明草莓多糖色素同样具有清除ABTS+·的活力。图7B所示,FRAP法抗氧化活性测试结果的作用趋势与草莓多糖清除ABTS+·大致相同,进一步验证了NKA-9大孔树脂可以有效吸附草莓多糖色素,而草莓多糖的抗氧化能力也随之降低。

图7 草莓多糖溶液脱色前后抗氧化活性测定Fig.7 Antioxidant activities of SP before and after decoloration注:A:ABTS+·清除能力;B:FRAP法抗氧化能性。

2.6 降血糖活性测定

草莓多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性测试如图8所示。图8A表明草莓多糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性呈量效关系,随着草莓多糖浓度增加(1～20 mg/mL),α-葡萄糖苷酶的抑制率也逐渐升高。同等浓度条件下脱色后的草莓多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率较脱色前显著增强(P<0.05),脱色前半抑制浓度(IC50)为9.798 mg/mL,脱色后为7.662 mg/mL,略高于阿卡波糖(IC504.452 mg/mL，图8B)。表明NKA-9大孔树脂脱色处理不仅能够吸附草莓多糖色素,而且提高了草莓多糖的纯度。按照Lineweaver-Burk双倒数曲线作图法,分别作出草莓多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制动力学拟合曲线。草莓多糖对α-葡萄糖苷酶动力学曲线如图8C所示,不同浓度草莓多糖和对照组抑制动力学曲线均相交于X轴负轴,随着草莓多糖浓度增加米氏常数Km和Vmax逐渐减少,呈现为混合型抑制特征。图8D表明草莓多糖对α-淀粉酶抑制活性作用趋势与其对α-葡萄糖苷酶抑制活性大致相同,随着草莓多糖浓度(0.5～10 mg/mL)逐渐增加,α-淀粉酶的抑制率也逐渐升高。同等浓度条件下脱色后的草莓多糖对α-淀粉酶的抑制率较脱色前显著增强(P<0.05),脱色前半抑制浓度(IC50)为4.184 mg/mL,脱色后为2.795 mg/mL,均显著高于阿卡波糖(IC5021.578 μg/mL,图8E，P<0.05)。草莓多糖对α-淀粉酶抑制动力学拟合曲线如图8F所示,随着草莓多糖浓度增加,Km和Vmax逐渐减少。不同浓度草莓多糖和对照组抑制动力学曲线的斜率(Km/Vmax)几乎保持不变,呈现出非竞争性抑制的特征,可能由于草莓多糖与底物结构不相似,不与底物竞争结合α-葡萄糖苷酶的活性位点。草莓多糖通过与酶的活性位点以外的部位结合,使酶分子形状发生变化,从而降低酶的活性[32]。

图8 α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性Fig.8 Inhibitory effect on α-glucosidase and α-amylase activity 注:A:草莓多糖α-葡萄糖苷酶抑制活性;B:阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性;C:脱色后草莓多糖对α-葡萄糖苷酶抑制动力学;D:草莓多糖对α-淀粉酶抑制活性;E:阿卡波糖对α-淀粉酶抑制活性;F:脱色后草莓多糖对α-淀粉酶抑制动力学。

3 结论

本实验以草莓为原料,通过水提醇沉、冷冻真空干燥得到草莓多糖,以多糖脱色率、保留率和选择系数为指标,比较了不同大孔树脂的脱色效果,结果表明NKA-9大孔树脂效率最高。采用单因素试验优化了KNA-9大孔树脂脱色工艺参数:样品初始浓度30 mg/mL,时间60 min,温度50 ℃,pH8.0,上样液体积为4.5 BV,上样液流速3.0 BV/h。草莓多糖具有良好的ABTS+·自由基清除能力、亚铁还原能力,草莓多糖经过脱色处理后抗氧化能力降低。草莓多糖是一种酸性杂多糖,由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸组成。草莓多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶在体外均具有较好的活性抑制作用,作为一种天然活性组分在降糖食品、保健品、药品方面具有良好的潜力,草莓多糖在体内的降糖作用和机制需要进一步深入研究。