玫烟色棒束孢IF-1106菌株液体培养条件优化

邓 欢，高亚婷，田 晶

（吕梁学院生命科学系，山西吕梁033000）

玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea），又称为玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosoroseus），属于子囊菌门肉座菌目虫草菌科棒束孢属[1]。它是一种寄生在昆虫身上的真菌，在自然界中可寄生在鳞翅目、双翅目、膜翅目等多种昆虫上，具有广泛的寄主范围，可对多种昆虫起致病作用[2-5]，尤其对刺吸式口器害虫具有良好的致病性[6]，被广泛用于生物防治[7]。

昆虫病原真菌玫烟色棒束孢主要通过固体发酵和液体发酵进行一定的繁殖、生产加工并用于实际生活[8-9]。目前，国内外对玫烟色棒束孢的研究报道主要在生物学、致病力测定、致病机制、防治应用等方面[10-12]。在不同的培养条件下，菌株的菌丝生物量、产孢量存在一定的差异[13]，因此，研究玫烟色棒束孢菌株菌丝生物量及产孢量的培养条件，是利用菌株进行生物防治的基础[14]。

本研究通过正交试验，探究玫烟色棒束孢最适液体培养条件，以扩大培养该菌，为其工业化生产提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 玫烟色棒束孢IF-1106菌株，分离自山西省太谷县温室大棚中，保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.7514。

1.1.2 培养基 PDA培养基；液体条件基础培养基：0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g KCl，1.0 g KH2PO4，0.1 g FeSO4·7H2O。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养方法 将玫烟色棒束孢IF-1106菌株试管斜面放置，保存在4℃冰箱中。在需要使用时，将其取出并在室温下活化24 h，接种在PDA培养基上，并且25℃培养于霉菌培养箱中[15]。当菌株长满培养皿的2/3时取出培养皿。

1.2.2 种子母液的制备 接种在PDA培养基上的菌株培养10 d后，用0.1%的吐温-80无菌水稀释，配制成孢子悬浮液[16]，并将孢子悬浮液的浓度调整为1×107cfu/mL。

1.2.3 菌丝生物量和产孢量的测定 在无菌条件下，将50 mL液体培养基加入到250 mL三角瓶中，按5%的接种量接入种子母液，在恒温摇床上培养，7 d后在显微镜下用血球计数板测定孢子数；将滤纸烘干至恒质量，对菌丝进行过滤后用蒸馏水洗涤，在60℃烘箱中烘干，用电子天平称质量[17]，测定菌丝生物量。

1.2.4 最适碳源和氮源组合的确定 以葡萄糖和蔗糖为碳源，蛋白胨和硝酸钠为氮源，将碳源、氮源与基础培养基组合，形成玫烟色棒束孢菌株液体培养的4种培养液，分别对菌株进行培养。根据其菌丝生物量和产孢量确定菌株生长的最适碳源和氮源，菌丝生物量和产孢量的测定方法同1.2.3。

1.2.5 单因素试验 在确定最适碳源和氮源为蔗糖和蛋白胨后，对蔗糖质量分数、蛋白胨质量分数、培养时间3个因素分别进行单因素试验。

1.2.5.1 蔗糖质量分数的确定 在0.2%的蛋白胨及基础培养基中分别加入2%、3%、4%、5%、6%的蔗糖，每个质量分数重复3次，培养6 d后测定其菌丝生物量和产孢量，测定方法同1.2.3。

1.2.5.2 蛋白胨质量分数的确定 在5%的蔗糖及基础培养基中分别加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的蛋白胨，每个质量分数重复3次，培养6 d后测定其菌丝生物量和产孢量，测定方法同1.2.3。

1.2.5.3 培养时间的确定 将5%的蔗糖、0.2%的蛋白胨及基础培养基组合成培养液，置于25℃的培养箱中培养9 d，从第5天开始每隔24 h取3瓶培养液，测定其菌丝生物量和产孢量，测定方法同1.2.3。

1.2.6 正交试验 根据单因素试验结果，每个因素选取较佳的3个水平进行正交试验，因素与水平列于表1。

1.3 数据分析

用SPSS17.0软件计算试验数据的平均值和标准误，用Duncan新复极差法比较均值的差异显著性。

表1 因素与水平

2 结果与分析

2.1 最适碳源和氮源组合结果

从图1、2可以看出，不同的碳源和氮源组合的产孢量和菌丝生物量均不同，且差异显著（P＜0.05）。当蔗糖、蛋白胨为碳源和氮源时，其菌丝生物量和产孢量均达最大值，分别为16.93 mg/mL和7.27×107cfu/mL。因此，蔗糖和蛋白胨为菌株的最适碳源和氮源。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 庶糖质量分数的确定 从图3、4可以看出，蔗糖质量分数为5%时，菌丝生物量和产孢量均达最大值，分别为7.7mg/mL和6.67×107cfu/mL。当蔗糖质量分数低于或高于5%时，菌丝生物量和产孢量均降低。由于蔗糖质量分数为4%、5%、6%时，菌丝生物量和产孢量均较大，所以，选择这3个蔗糖质量分数作为正交试验的因素和水平。

2.2.2 蛋白胨质量分数的确定 由图5、6可知，不同氮源条件下菌丝生物量及产孢量差异显著（P＜0.05）。蛋白胨质量分数为0.5%时，菌丝生物量和产孢量差异性最显著，均为最大值，分别为11 mg/mL和11.43×107cfu/mL。由于0.5%、1.0%、1.5%这3个蛋白胨质量分数较接近，所以，选择这3个蛋白胨质量分数作为正交试验的因素和水平。

2.2.3 培养时间的确定 由图7、8可知，不同培养时间下菌丝生物量及产孢量差异明显（P＜0.05）。随着培养时间的增加，菌丝生物量及产孢量均呈上升趋势，到第6 d时，菌丝生物量、产孢量达到最大值，分别为17.27 mg/mL和7.8×107cfu/mL，此后菌丝生物量及产孢量均又呈下降趋势。由于5、6、7 d这3个培养时间较接近，所以，选择这3个培养时间作为正交试验的因素和水平。

2.3 正交试验结果

表2 菌丝生物量正交试验结果

从表2、3可以看出，影响玫烟色棒束孢的菌丝生物量和产孢量大小顺序均为：培养时间＞氮源＞碳源。根据极差分析得出，菌丝生物量和产孢量的最优培养条件不完全一致，获得最多菌丝生物量的最优组合为A2B3C2，即蔗糖质量分数5%、蛋白胨质量分数1.5%、培养时间6 d；获得最多产孢量的最优组合为A1B1C3，即蔗糖质量分数4%、蛋白胨质量分数0.5%、培养时间7 d，以此为试验条件得出产孢量为7.53×107cfu/mL。

表3 产孢量正交试验结果

3 结论与讨论

对玫烟色棒束孢IF-1106菌株而言，碳源选用蔗糖、氮源选用蛋白胨的培养基菌丝生物量和产孢量较大。通过正交试验得出，对菌丝生物量和产孢量的影响因素排序均为培养时间＞氮源＞碳源，蔗糖质量分数5%、蛋白胨质量分数1.5%、培养时间6 d时，菌丝生物量最大；蔗糖质量分数4%、蛋白胨质量分数0.5%、培养时间7 d时，产孢量最大。

由结果可以得出，适合菌丝生长的碳、氮源质量分数和适合产孢的碳、氮源质量分数是不一致的，说明适合菌丝生长的培养基与适合产孢的培养基是不一致的[18]。当需要菌丝生物量多时，可以选用蔗糖质量分数为5%、蛋白胨质量分数为1.5%的培养基；当需要产孢量多，制备孢子粉时，可以选用蔗糖质量分数为4%、蛋白胨质量分数为0.5%的培养基。