重组鸡细胞外脂肪酸结合蛋白的原核表达及鉴定

田志雄，李娜娜，卢晓晓，2，郭 敏，张 宁，李 欣，张 鼎，赵宇军，闫 芳，高荣琨，宁官保，田文霞

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.温县农林局，河南温县454850；3.晋城市科学技术局，山西晋城048000）

包括脂肪酸（FAs）等在内的脂类是所有细胞的基本生化组成，具有多种生物学作用，即作为生物膜的结构成分、能量来源和一系列细胞调节功能等[1]。脂肪酸结合蛋白（FABPs）是一种质量较小的水溶性蛋白，迄今为止，已鉴定出12个FABP家族成员，其中，10个亚型也在人类中表达[2-3]。FABPs主要参与动物体内的脂肪酸代谢，具有调节基因转录的能力[4]。细胞外脂肪酸结合蛋白（Extracellular Fatty Acid-binding Protein，Ex-FABP）是一种鸡胚发育过程中表达于肥大软骨、肌肉纤维和血粒细胞中的脂蛋白，最初命名为Ch21，后来由于其结合特性而被重新命名为Ex-FABP[5]。这个低分子量蛋白属于lipocalin家族，其家族共享相似的b-桶三级结构[6]。因此，细胞外脂肪酸结合蛋白与亲脂性小分子物质（如类维生素A、脂肪酸、胆固醇、前列腺素、信息素和增香剂等）具有相同的功能[7]。有研究发现，胞外脂肪酸结合蛋白还具有控制细胞凋亡的功能[8]。

本试验通过原核表达方法克隆鸡Ex-FABP基因，将目的基因连接到克隆载体pGEM-TEasy上，然后与pET-28a（+）载体连接，并转化到BL21（DE3）进行诱导表达蛋白，最后经鉴定得到Ex-FABP蛋白，旨在为后续进行动物体内试验以及家禽疾病的研究提供一定理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

pET-28a载体由山西农业大学生物制品实验室保存；Trizol、PCR聚合酶购自大连TaKaRa公司；DNA ladder、DNA loading buffer购自中科瑞泰生物有限公司；Agarose-G10购自Biowest公司；限制性核酸内切酶Eco RⅠ、XhoⅠ购自New England Biolabs公司；pGEM-TEasy克隆载体购自Promega公司；SDS、Glycine、Coomassie Blue Staining Solution和50×TAE缓冲液购自北京博奥拓达公司；Anti-6×His tag抗体购自Abcam公司；Carnamycin sulfate、SYBRGreen I核酸染料、氨苄青霉素、丙烯酰胺、Imidazole、甲叉丙烯酰胺、Ammoniumpersulphate、四甲基乙二胺、蛋白Marker、丽春红、羊抗小鼠IgG二抗和NC膜购自Solarbio科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 按照NCBI中公布的鸡Ex-FABP基因序列（AF121346.1），通过使用DNAMAN、Primer软件设计引物，并在上下游引物添加酶切位点Eco RI和Xho I以及保护性碱基。

上游引物：5′-CGGAATTCGCGGCCACAGTGCC GGA-3′；下游引物：5′-AGCTCTCGAGCTACACTTC ATCAAGCTGCAT-3′。

1.2.2 Ex-FABP基因克隆与鉴定 取鸡的胫骨生长板，使用Trizol法提取RNA，反转录获得cDNA，然后进行PCR扩增，通过凝胶电泳检测结果，并回收目的条带。

1.2.3 鸡Ex-FABP重组表达质粒的构建与鉴定采用双载体系统构建目的质粒，即首先将目的基因连接到克隆载体pGEM-TEasy上，获得重组克隆质粒T-Ex-FABP；然后取适量重组克隆质粒T-Ex-FABP和表达质粒pET-28a（+）同时进行酶切，并检测结果；用T4 DNA连接酶将Ex-FABP基因和pET-28a（+）载体连接，并转化到BL21（DE3）感受态细胞，接于LB板上，通过Kana抗性选出阳性菌落进行PCR鉴定；将鉴定正确的菌液提取质粒，经双酶切鉴定正确后进行测序分析，获得表达载体pET-28a-Ex-FABP。

1.2.4 Ex-FABP重组蛋白的诱导表达及条件优化将重组质粒pET-28a-Ex-FABP转入到BL21（DE3），接种到含Kana的LB板上，37℃培养12 h；随机挑取单菌落于含Kana的LB培养基，当OD600为0.5～0.7时添加IPTG诱导；诱导结束后进行细菌破碎，12 000 r/min 4℃离心30 min，然后分别通过SDSPAGE鉴定沉淀或上清中蛋白表达情况。

鉴定蛋白表达形式后，菌液继续进行分组诱导培养，以摸索诱导表达的最佳条件。分别从IPTG浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）、诱导温度（25、30、37℃）、诱导时间（6、12、21 h）3个方面来检测诱导条件对Ex-FABP表达的影响。

1.2.5 Ex-FABP重组蛋白的纯化 以最佳的诱导条件继续进行诱导表达，之后收集菌体，PBS洗菌3次，使用超声波裂解破碎细菌，吸取上清，用无菌滤器过滤。本试验选择的载体为pET-28a（+），携带有His标签，可直接进行镍柱层析法纯化蛋白。将无菌过滤的样品与Binding Buffer等比例混合上柱，分别用不同浓度（10、20、30、40 mmol/L）的咪唑洗杂，用500 mmol/L的咪唑冲洗Ex-FABP蛋白，收集Ex-FABP蛋白，通过SDS-PAGE鉴定结果。

1.2.6 Western Blot鉴定Ex-FABP重组蛋白 SDSPAGE电泳后转膜，用丽春红染色，再用蒸馏水洗脱，脱色后的膜加入TBST稀释的5%脱脂奶粉进行封闭；加入用1∶1 000稀释的Anti-6×His tag抗体，4℃孵育4 h；回收抗体后用TBST洗涤3次；再加入用TBST按1∶5 000稀释的IgG抗体，37℃摇动孵育1 h；TBST洗涤后取出NC膜，将ECL发光液均匀覆盖于膜表面，放入暗盒中观察，扫描记录结果。

2 结果与分析

2.1 目的基因PCR扩增结果

预期的Ex-FABP基因大小为495 bp，在500 bp左右出现条带（图1），表明扩增得到了目的基因Ex-FABP。

2.2 重组克隆质粒T-Ex-FABP的序列测定结果

菌液PCR结果显示，在500 bp左右出现特异性条带（图2），提取质粒后送上海美吉生物公司进行测序，结果显示，序列同源性为99%，表明重组克隆质粒构建成功。

2.3 p ET-28a-Ex-FABP表达载体的鉴定

重组表达质粒用Eco RⅠ和XhoⅠ同时酶切后进行鉴定，可见相应的2条电泳带（图3），并且Ex-FABP基因在500 bp左右位置，序列经过分析后完全正确，证明重组pET-28a-Ex-FABP质粒连接成功；同时空质粒pET-28a也进行双酶切，结果显示，有相应的一条带（图3）。

2.4 Ex-FABP重组蛋白的诱导表达及条件优化

2.4.1 Ex-FABP重组蛋白的诱导表达 将重组载体转入BL21（DE3），得到含有目的基因的BL21/Ex-FABP，诱导表达后进行SDS-PAGE鉴定，加上His标签后Ex-FABP蛋白大约是24 ku，结果显示，诱导后菌液在20.1～31.0 ku有一条带；未诱导菌液在相同位置无条带（图4）。并且，Ex-FABP重组蛋白在上清和沉淀中均有分布，取同等上样量进行检测发现，上清中蛋白表达量远高于沉淀（图5）。

2.4.2 Ex-FABP重组蛋白表达的条件优化 利用SDS-PAGE对蛋白表达的IPTG浓度、诱导温度及诱导时间进行检测，结果显示，0.2 mmol/L IPTG、30℃、21 h为Ex-FABP重组蛋白表达的最佳条件（图6～8）。

2.5 Ex-FABP重组蛋白的纯化及鉴定

2.5.1 Ex-FABP重组蛋白的纯化 Ex-FABP重组蛋白的裂解液上清经纯化后，用500 mmol/L的咪唑冲洗，可得到较纯的目的蛋白（图9）。

2.5.2 Ex-FABP重组蛋白的免疫印迹鉴定结果由图10可知，通过Western Blot鉴定纯化后，上清中出现单一特异性条带，即纯化得到目的蛋白Ex-FABP；而未诱导菌液中无条带。

3 结论与讨论

脂肪酸结合蛋白（FABPs）是一类与配体相关的水溶性蛋白，其大小为14～15 ku，在与高代谢活性和脂质存储相关的组织中大量表达，迄今为止，已鉴定出12个FABP家族成员[9-10]。尽管最初是根据首次描述FABP表达的组织类型命名，但是后来发现有些FABP成员在多个组织中都有表达，并且可以共同表达。虽然FABP家族成员只表现一定的序列同源性，但是不同家族成员之间的三级蛋白质结构基本相似，由10条反平行的β链组成，形成β桶结构[3]。FABP表达的失调可能是通过基因突变或环境生活方式的影响而发生。近年来，FABP在肿瘤生物学中的作用越来越多地被报道，外源性FABP的表达升高与肿瘤的进展和侵袭性有关，但内源性FABP过表达的作用还有待进一步研究。

Ex-FABP是一类不含甘露糖的蛋白质，具有链内二硫键构象，可抵抗有限的胃蛋白酶消化[11]。BEDARD等[12]也发现了相同的蛋白，分泌于鸡胚成纤维细胞和鸡心脏间充质细胞，称为p20K蛋白。ExFABP和p20K都是禽类蛋白，在其他物种特别是小鼠和人中还没有明确的同源性。在分化软骨和肌管时，炎症因子（脂多糖等）明显上调Ex-FABP蛋白合成；而抗炎药抑制生理表达的蛋白合成，并且阻止脂多糖诱导的蛋白合成[13]，表明Ex-FABP可能在肌管分化和成熟过程中发挥反馈（自分泌）控制作用，并可能在维持细胞活力方面发挥作用[14]。本试验通过引物设计获取鸡Ex-FABP基因，并连接到质粒pET-28a（+）上，转化至BL21（DE3）进行培养，摸索最佳诱导条件，表达了大量纯度比较高的Ex-FABP蛋白，结果为后续的动物试验以及家禽疾病的研究提供了依据。

本试验选择的是原核表达体系，其可以快速得到大量的目的蛋白，而且所需的成本比较低，方法也比较简单，可以表达的蛋白也比较多[15]。缺点在于表达出来的蛋白没有经过修饰，不一定有天然的活性[16]，且无法调控水平和时间，蛋白经常存在于包涵体中，导致产物纯化困难。真核表达系统虽然可以进行相应的修饰，但是周期较长，速度慢，获得的蛋白产量低。本试验采用的是原核表达系统，但是Ex-FABP为真核基因，所以后期还需要进行加工修饰，即表达出的蛋白需经过透析等过程，使蛋白具有功能活性。

在原核体系中，最常用的宿主菌为大肠杆菌，其具有背景明确、快速便捷、产量较高的优点[17-18]。目前，在大肠杆菌表达体系中，最常用的质粒有pET、pGEX等。这2种系列表达质粒均带有纯化标签，即His标签和GST标签[19]。而由于His标签具有分子量小、免疫原性低、无需处理即可进行动物体内试验等特点，以及考虑到本试验的下游试验所需蛋白要求，故选用了存在His标签的pET-28a（+）质粒。而且选择pET系统表达蛋白时，如果不添加诱导剂，诱导表达过程几乎不进行。本试验根据pET-28a（+）的质粒图谱，在引物设计时选择Eco RⅠ和XhoⅠ限制性内切酶，使Ex-FABP基因可以顺利连接到pET-28a（+）载体上，并且本试验选用了适合pET表达载体的BL21（DE3）菌株作为宿主菌。

为了得到大量的重组Ex-FABP蛋白，本试验还对IPTG浓度、诱导温度及时间进行了分组测定，结果得出，IPTG浓度对试验没有较大影响；温度为30℃时的表达量要高于25、37℃；诱导时间为21 h时蛋白表达量高于6、12h。即IPTG终浓度0.2mmol/L、诱导温度30℃、诱导时间21 h为Ex-FABP蛋白表达的最佳诱导条件。

本试验成功构建了重组质粒pET-28a-Ex-FABP，并对重组Ex-FABP蛋白进行了纯化、SDS-PAGE和Western Blot鉴定，得到了纯度较高的重组蛋白，构建了一套鸡Ex-FABP蛋白的表达程序，结果可为后续的动物试验以及家禽疾病的研究提供理论依据。