百香果叶片植株再生快繁技术

苏 艳，杨宝明，王丽花，李永平，黄玉玲，李迅东，尹可锁，张艺萍，杨超振

（1.云南省农业科学院花卉研究所，农业农村部花卉产品质量监督检验测试中心（昆明），国家观赏园艺工程技术研究中心，云南昆明650205；2.云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南昆明650205；3.云南省农业科学院热区生态农业研究所，云南元谋651300）

百香果（Passiflora edulis Sims）又名鸡蛋果、西蕃莲、洋石榴，属西蕃莲科西蕃莲属的滕本植物，为热带亚热带多年生植物；果实富含人体所必需的17种氨基酸、多种维生素、类胡萝卜素和微量元素，营养价值极高；可溶性固形物含量5%～16%，总酸量3.8%～4.0%，甜酸适中，素有“果汁之王”的美誉。其根、茎、叶可入药，具有消炎、止痛、活血、强身等功效[1-2]。

近年来，随着百香果的综合开发[3-6]和高产栽培技术的推广应用[7-11]，其种植面积逐年加大，主要集中种植于广西、广东、云南、海南、福建等地[12-16]，市场对种苗的需求也越来越大。目前，种苗的繁殖方式主要有3种：用种子播种繁殖；用滕蔓扦插繁殖；用接穗嫁接繁殖。其中，种子播种繁殖，浪费果实、生长周期长、用工量大；扦插繁殖，需要大量滕蔓、易传播病害、加快品种退化；嫁接繁殖，种苗质量好，但占地面积大、成苗周期长、种苗价格高。3种繁殖方法均存在占地、耗时、周期长、生长成本高等问题，受季节、环境、天气等影响，同时还会加剧病害传播[17-18]。因此，应用植物组织培养技术，建立百香果无性快繁体系，是产业化、规范化生产百香果优质种苗最有效的途径[19-20]。

本试验以百香果种子无菌实生苗的子叶、真叶以及田间枝条茎尖嫩叶为外植体，开展百香果组培快繁技术试验，旨在为百香果组培苗适宜的生产方式提供数据参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料于2017年7月采自云南省昆明市石林县百香果种植园。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体选择 于晴天选择生长健壮、长势良好、无病虫害的紫果百香果实及3～4 cm长茎尖。

1.2.2 外植体灭菌 果实灭菌。将果实放在自来水下冲洗，并用肥皂水刷洗果实表面（注意果实表面不能破损）；清洗干净后，在无菌工作台内，用75%酒精反复擦拭果实表皮4～5次，备用。

茎尖的灭菌。剪除茎尖不要的老叶，用自来水反复冲洗，再用肥皂水清洗，清洗干净后，在无菌工作台内，先用75%酒精浸泡30 s，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡10 min；然后用无菌水冲洗4～5次，再用无菌滤纸吸干表面水分，备用。

1.2.3 种子无菌实生苗的培养 将经无菌处理的果实从中部切开，挑选个大、饱满的种子直接接种到经过灭菌处理的装有珍珠岩（含水量为80%左右）的培养瓶中，经35～40 d培养，即可得到高度为4～5 cm的实生苗。

1.2.4 外植体愈伤组织诱导培养 将经无菌培养得到的实生苗按子叶、真叶部位切割；田间茎尖直接将未完全展开的嫩叶切割下来，分别接种到1～8号处理的培养基中，于第35天统计出愈率及不定芽分化情况。每处理接种5瓶，每瓶接种1块，3次重复。

1.2.5 丛生芽诱导培养 将经愈伤组织诱导培养得到的愈伤组织或芽丛，切割为0.5 cm2左右的小块，接种到9～14号处理的培养基中，于第25天统计不定芽的分化率及分化情况。每处理接种5瓶，每瓶接种1块，3次重复。

1.2.6 腋芽培养 将经丛生芽诱导培养得到的芽或芽丛，分割为含2～3个茎节的茎段或含2～3个芽的芽丛，接种到15～22号处理的培养基中，于第25天统计芽的分化率及生长情况。每处理接种3瓶，每瓶接种1块，3次重复。

1.2.7 生根壮苗培养 将经腋芽培养得到的芽，切割为含2～3节的植株，接种到23～27号处理的生根培养基中，30 d统计生根率及根系生长情况。每处理接种5瓶，每瓶接种5株，3次重复。

1.2.8 培养基及培养条件 以MS为基本培养基，附加蔗糖30 g/L、琼脂5 g/L，pH值5.8～6.0。培养室温度为（25±2）℃，光照强度为1 600～2 000 lx，光照时间为12 h/d。

1.3 数据统计

采用SPSS统计分析软件进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同处理对百香果外植体愈伤组织诱导的影响

表1 不同处理对不同叶片愈伤组织诱导分化的影响

由表1可知，无菌实生苗的子叶、真叶经诱导培养均可产生愈伤组织；最容易诱导产生愈伤组织的部位是子叶，最难诱导的部位是大田茎尖嫩叶；在1～8号处理中，子叶愈伤组织分化早、生长快，接种18 d左右开始分化愈伤组织，出愈率达100%，并在产生愈伤组织的同时还有大量不定芽分化；其次为真叶，最高出愈率为33%；大田茎尖嫩叶没有愈伤组织分化，接种10 d后叶片逐渐变黄或死亡，这可能与灭菌时间过长有关。从8个处理的培养基总体培养效果相比来看，以7号处理的培养基诱导效果最好、诱导能力最强。因此，MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L为最佳子叶愈伤组织诱导培养基。

2.2 不同处理对丛生芽诱导分化的影响

由表2可知，丛生芽的分化数与细胞分裂素的种类和浓度直接相关，6-BA和KT都能诱导丛生芽的产生；从9～14号6个处理的培养效果来看，6-BA的作用效果明显好于KT，6-BA更适合丛生芽的诱导和增殖，但当6-BA质量浓度超过1.0 mgL时，培养物的基部容易产生大量的愈伤组织，影响丛生芽的生长，丛生芽密集，芽丛生长缓慢，不长高，丛生芽的分化数量反而呈下降趋势，说明高浓度的6-BA会抑制芽的增殖。因此，MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L为诱导丛生芽的最佳培养基。

表2 不同处理芽丛的分化生长情况

2.3 不同处理对腋芽增殖的影响

将经丛生芽诱导培养得到的芽或芽丛切割为带2～3个茎节的茎段或分割为含2～3个芽的芽丛，接种到15～22号处理的培养基中，通过促进腋芽萌发、生长的方式实现植株的增殖。由表3可知，6-BA和IBA配合使用的效果要好于6-BA和NAA配合，在6-BA质量浓度相同时，加入IBA的处理，腋芽萌发早、数量多、生长快、长高明显、植株基部愈伤组织小；加入NAA的处理，腋芽萌发数量较少、腋芽生长缓慢，不长高，植株基部产生大量愈伤组织，接触培养基的叶片易发生卷曲等情况。当6-BA质量浓度为1.0 mg/L、IBA质量浓度为0.2 mg/L时，腋芽萌芽数量达2.86个，高度达4.82 cm，是15～22号8个处理中长势效果最好的处理。因此，腋芽增殖最佳培养基为MS＋6-BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L。

表3 不同处理腋芽的生长情况

2.4 生根壮苗培养

表4 不同处理对百香果根系生长的影响

由表4可知，在培养基中添加NAA或NAA和IBA，都能诱导植株生根，不同处理，根系及植株的生长情况各不相同，存在一定的差异；添加NAA的处理生根相对较快，接种20 d左右开始长出根系，根系粗、短、整齐，但根系脆，基部愈伤组织大；NAA和IBA配合使用的处理，生根相对要慢4～5 d，但根系更长一些、细一些，根系的柔韧性更好一些，基部愈伤组织不明显；在5个处理中，以24、27号这2个处理效果最好，生根率分别为81.3%和65.3%。因此，生根培养基以MS＋NAA 0.3 mg/L为最佳。

3 结论与讨论

本试验以百香果种子无菌实生苗的子叶、真叶以及田间茎尖嫩叶为繁殖材料，研究叶片植株再生快繁技术，结果表明，百香果种子灭菌容易、彻底、污染率低；茎尖嫩枝，存在灭菌不彻底、培养中污染率高等问题，这与史沉鱼等[21-22]的研究结果一致。实生苗的子叶、真叶经诱导培养都能产生愈伤组织，而子叶是最好的无性繁殖材料，愈伤组织分化早、生长快，愈伤组织诱导率可达100%，并在产生愈伤的同时可直接分化不定芽丛，最佳子叶愈伤组织诱导培养基为MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；茎尖嫩叶没有成功，接种15 d后叶片逐渐变黄或死亡，可能与灭菌的方法和时间过长有关。在丛生芽的诱导培养中，相同质量浓度的6-BA和NAA组合使用的效果明显好于KT和NAA组合，6-BA和NAA配合使用，丛生芽分化数量多，芽丛粗壮、整齐，当6-BA质量浓度为1.0～1.5 mg/L时，有利于愈伤组织丛生芽的分化和生长，最佳丛生芽分化培养基为MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L。在腋芽的增殖培养中，6-BA和IBA促进腋芽萌发和生长的效果好于6-BA和NAA[22-23]，加入IBA的处理，腋芽萌发更早，生长更快，植株基部愈伤组织小，长势良好，但当6-BA质量浓度高于1.0 mg/L时，对腋芽的萌芽和生长有抑制作用，最佳腋芽增殖培养基为MS＋6-BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L。MS＋NAA 0.3 mg/L培养基适合生根，为最佳生根壮苗培养基。