市售卤牛肉中腐败菌的分离鉴定

刘彩云 祝泉馨 方彦昊 张文齐 张建梅邓禄印 祝 英* 王治业 麻和平 邵建宁

1.甘肃省微生物资源开发利用重点实验室甘肃省科学院生物研究所 甘肃兰州 730000 2.威海海洋职业学院 山东威海 264315 3.烟台喜旺食品有限公司 山东烟台 443000

卤肉制品属于低温肉制品，因其极大程度上保留了肉品的风味、营养，而且因其香鲜美味、品种繁多，深受消费者的喜爱[1]。作为一种传统中式食品，卤肉制品在国内消费群体稳定，市场发展空间广阔[2]。然而，由于卤肉制品营养丰富、水分活度较高，并且我国卤肉制品的生产以作坊式为主，在贮藏、销售过程中很容易被微生物污染而导致腐败变质[3～5]。

肉品的腐败变质主要是由微生物引起，有些微生物在肉中生长繁殖，生成挥发性脂肪酸、有机酸、乙酯、硫化合物、醛、酮、醇、氨等物质，从而导致肉发生变色并产生异味，影响肉的食用；有些微生物将肉中的蛋白质逐渐分解成脂肪酸、胺类、硫化氢、氨等低分子化合物，产生恶臭气味，进而使肉发生腐败变质[6]。国内外对鲜肉、高温肉制品微生物的研究较多，而对低温肉制品的研究则相对较少。据报道能够引起鲜肉、高温肉制品腐败的微生物有乳杆菌属、假单胞菌属、梭菌属、小球菌属、变形菌属、芽孢杆菌属等[7]，而影响低温肉制品质量的微生物比较复杂，且由于肉制品配方各异，原料多样，受不同因素如温度、加工、包装、有氧或无氧、贮藏方法和防腐剂等影响，会呈现不同腐败微生物群[8～12]。

考虑低温肉制品杀菌和储存条件与鲜肉、高温肉制品差异很大，本研究拟从市售卤牛肉中分离引起卤肉腐败的细菌，并对腐败菌进行形态和分子生物学鉴定，已确定引起市售卤牛肉腐败的主要微生物，旨在为低温肉制品的储存、延长货架期等问题的解决提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源与处理

隔夜卤牛肉(购自华联超市红星店)，将其切成薄片，称取25g为一份，装入包装袋抽真空包装，置于10℃培养箱内，分别于0、2、4、6、8、10、12d取样，测定菌落总数。

1.2 培养基和试剂

平板计数琼脂培养基，北京双旋微生物培养基制品厂；

细菌染色液，革兰氏染色；氯化钠，分析纯，天津市百世化工有限公司；

胰蛋白胨、酵母粉、牛肉浸粉、琼脂粉、EDTA、TRIS-HCl、十二烷基硫酸钠SDS，北京索莱宝科技有限公司；

PCR扩增试剂盒PrimeSTAR© HS DNA Polymerase，宝生物工程(大连)有限公司；

250bp DNA Ladder，北京擎科新业生物技术有限公司。

1.3 仪器与设备

MJ-250-1霉菌培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；

HZQ-QX全温振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；

LOZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；

JJ-2B型组织捣碎匀浆机，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；

PCR仪T100TMThermal Cycler，PowerPac Basic电泳仪；

高电流型电泳电源PowerPac HC Power Supply、凝胶成像分析系统Gel imaging system GelDoc XR+，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；

高速台式冷冻离心机eppendorf Centrifuge 5417R，艾本德(上海)国际贸易有限公司；

冷冻型高通量组织破碎仪SCIENTZ-48L，宁波新芝生物科技股份有限公司；

正置生物显微镜，重庆澳蒲光电技术有限公司；

JA2003N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；

TD4超净工作台，常州金坛良友仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 腐败菌的培养

取1袋样品，加在装有225mL无菌生理盐水的均质器内，以8 000r/min均质1min，制成浓度为10-1的均匀稀释液，转至500mL三角瓶静置。取1mL上清液进行10倍梯度稀释，选择10-3、10-4、10-5等3个稀释度，取0.2mL稀释液涂布于培养基上，每个稀释度做3个重复，并做空白对照，于36℃培养48h±2h，观察计数。

1.4.2 腐败菌的分离纯化

从平板上挑取典型生长菌落，反复进行平板划线分离，得到纯化的单菌落，保存于试管斜面备用。

1.4.3 菌落及个体形态观察

观察各菌株单菌落的大小、形状、边缘结构、颜色等，并以革兰氏染色观察个体形态。

1.4.4 时间对腐败菌生长的影响

将真空包装后的卤牛肉置于10℃下贮藏,定时取样,采用平板菌落计数法(36℃培养48h)进行细菌总数的测定，平行重复3次，取其平均值。

1.4.5 菌种鉴定

将分离得到的菌株接到液体培养基中37℃培养过夜，离心收集菌体，高通量组织破碎仪充分破碎，用SDS法提取基因组DNA，电泳检测合格后用于PCR扩增。16S rDNA的PCR扩增仪提取的DNA作为模板，采用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')扩增目的片段的基因。

PCR反应体系为50uL:5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)10uL，正反引物各2uL，dNTP Mixture(各2.5 mM)4uL，PrimeSTAR R HS DNA Polymerase(2.5 U/uL)0.5uL，DNA模板1uL，ddH2O 30.5uL。

PCR扩增条件:98℃变性10s；56℃退火15s，72℃延伸1min30s，30个循环;72℃延伸5min。将扩增产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 菌落特征和菌体形态

36℃培养2d后观察，培养皿上只长了2种菌落，一种菌落大小0.3～1mm、乳白色、圆形、光滑不透明、质地粘稠、无光泽、微隆起、边缘整齐，编号为N1(图1a)；另一种菌落大小1～2mm、白色、圆形、光滑、无光泽、不透明、边缘整齐，编号为N2(图1b)。本研究结果初步确定了这2种菌是引起本地卤牛肉腐败的主要微生物。

图1 卤牛肉中主要腐败菌的形态图片Fig. 1 Picture of main spoilage bacteria in brine beef

将2种菌进一步分离纯化后，用油镜观察2种菌的显微形态特征，N1(图2a)呈短杆状，两端呈圆形、无芽孢；N2(图2b)呈杆状、无芽孢。

图2 卤牛肉中主要腐败菌的显微图片(×1000倍)Fig. 2 Micrographs of main spoilage bacteria in brine beef

对2株菌进一步革兰氏染色，均为阳性，2株菌的菌落及形态特征总结见表1，经查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》根据菌落和形态特征初步判定N1为魏斯氏菌属，N2为佐氏库特氏菌属。

表1 菌落特征以及形态

2.2 微生物菌落总数结果分析

卤牛肉通常在10℃冷藏柜中出售，而在该温度下腐败菌生长速度的快慢关系到卤牛肉货架期的长短。因此，本研究选择10℃下贮藏，分别于0、2、4、6、8、10、12d取样，分析2种腐败菌株随贮藏时间的变化，分析结果如图3所示。

图3 10℃贮藏菌落总数的变化Fig. 3 Changes of the Microbial counts stored at 10℃

结果显示，在10℃贮藏条件下，随着贮藏时间的增加，2株菌的菌落总数均呈现指数增长。当贮藏期到达第4天时，菌落总数接近104CFU/mL。当菌落总数高于104CFU/mL为微生物超标商品。因此该卤牛肉制品在10℃贮藏条件下的保质期最多是4d。

2.3 菌株分子鉴定

2.3.1 菌株的PCR扩增结果

对N1和N2菌株16S r DNA序列PCR扩增后进行电泳,得到重复、稳定、清晰的特异条带，片段大小约1 500bp，扩增结果如图4所示。

图4 菌株的16SrDNA PCR电泳图谱(Marker:250bp)Fig.4 PCR amplification of 16S rDNA genes(Marker:250 bp)

2.3.2 菌株的16S rDNA序列分析

将N1和N2菌株16S rDNA扩增产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序，对其进行测序分析,通过NCBI网站Blastn工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)选取同源性最高的菌株序列，并选取冷鲜鸡肉优势腐败菌Pseudomonas pseudoalcaligenes16S rRNA序列作为外类群[13]用MEGAX进行多重序列对比，并以Maximum-Likelihood法构建系统发育树(图5)。结合图5系统发育树和核酸序列比对可知，N1与魏斯氏菌(Weissella viridescens strain WM33)亲缘关系为100%，N2与佐氏库特氏菌(Kurthia zopfii)亲缘关系为100%。

图5 基于16SrRNA序列同源性的2菌株的系统发育树Fig. 5 Phylogenetic tree of 2 strains base on 16S r RNA gene analysis

3 讨论

微生物生长繁殖是影响低温肉制品货架期的决定性因素[14]，低温肉制品由于热加工温度低，导致产品中真菌孢子、细菌芽胞和部分耐热细菌残存，在后期的贮存和销售过程中，那些残存的微生物经过短暂的适应、修复后将重新生长繁殖，最终引发肉制品感官品质下降、导致产品腐败变质、从而影响其货架期[15～17]。同时，低温肉制品因其肉的种类差异、组织状态、配方成分、加工方式、包装方式及贮藏方式的不同，容易污染的微生物的种类和数量也不同[18～20]。谢萍[21](2015)等报道散装酱卤鸭肉贮藏期间的致腐微生物主要是葡萄球菌、溶酪大球菌等；祝莹[22](2011)等报道镇江肴肉中的主要腐败菌有荧光假单胞菌、波罗的海希瓦氏菌、解鸟氨酸拉乌尔菌；张依洁[23](2017)等报道真空包装酱卤鸭肉的主要优势腐败菌有假单胞菌、乳酸菌、肠杆菌、葡萄球菌和微球菌。本研究发现引起本地卤牛肉腐败变质的致腐微生物是魏斯氏菌和佐氏库特氏菌。

魏斯氏菌属为革兰氏阳性、兼性厌氧菌，属于异型发酵乳酸菌，能够导致食品的腐败变质[24,25]。最适生长温度为30～37℃，不致病[26]，生存环境范围比较广泛，植物性材料、肉类制品以及人和动物的粪便中均可分离得到[27]。肉类加工中最常见的魏斯氏菌种类是绿色魏斯氏菌，Marta Dušková[28](2013)等报道绿色魏斯氏菌是导致肉制品产生黏液并且发绿的主要原因，黏液起初在湿润表面的单个菌落上出现，不久逐渐形成一片绿色的黏液，之后从肉表面往里渗透。肉变绿的根本原因是由于形成了过氧化氢，过氧化氢能够氧化亚硝基肌色原(肉制品的色素)，使之呈现绿色，这也是当暴露于氧气中时，各种包装肉制品(香肠、烟熏肉、真空包装肉)会出现变绿的原因[28～30]。关于魏斯氏菌，研究更多的是关于它引起肉变绿的原因与机制，而本研究发现魏斯氏菌是引起本地卤牛肉腐败变质的腐败菌之一，当卤牛肉中的魏斯氏菌数量达到一定程度时，卤牛肉便会出现明显的腐败变质。

库特氏菌属为革兰氏阳性、好氧菌，不生孢不抗酸。最适生长温度20～35℃，不致病，广泛分布于环境中，常见于动物粪便和肉类产品，可引起食品的腐败变质[31,32]。李除夕[33](2009)等人报道库特氏菌被确定为引起豆腐腐败变质的特定腐败微生物，而且是直接影响豆腐货架期的因素。本研究发现库特氏菌属的模式种佐氏库特氏菌是引起本地卤牛肉腐败变质的腐败菌之一，随着贮存时间的延长，佐氏库特氏菌增长迅速，从而导致产品细菌超标，同时引起产品腐败变质。

为了延长卤牛肉货架期，建议卤牛肉生产者在生产过程中应该对生产人员、加工环境进行严格的卫生管理，同时对加工工艺以及包装材料等采取有针对性的综合控制措施，合理确定危害分析关键控制点，防止腐败菌的生长繁殖，保证卤牛肉的食用安全。另外，有些生产者为了延长卤牛肉的货架期,选择在卤牛肉中添加一定量的防腐剂，但是目前常用的化学合成防腐剂对人类健康存在着一定的潜在危害，随着人们对食品安全的要求越来越高，绿色、安全、广谱的天然防腐剂越来越受到人们的青睐，在未来的生产中可以考虑通过添加一定的中药保鲜剂等生物防腐剂延长卤牛肉的货架期。

4 结论

本研究对贮藏在10℃条件下的真空包装卤牛肉中的腐败菌进行分离纯化，并通过菌落形态、菌体形态观察和16S rDNA分子鉴定方法，对菌群中的特征腐败菌进行了分离鉴定。结果表明，分离得到的2株菌魏斯氏菌(Weissella viridescens strain WM33)和佐氏库特氏菌(Kurthia zopfii)是引起本地卤牛肉腐败的关键菌株，也是影响卤牛肉货架期的重要因素。本研究为卤牛肉加工、贮藏过程中有针对性地控制微生物污染提供借鉴和参考，同时为进一步采取有效的防腐保鲜措施、延长卤牛肉的货架期提供了理论依据。