魔芋葡甘聚糖及氧化魔芋葡甘聚糖对益生菌生长及乳糖代谢作用的体外研究

芦雨佳,毛凯雯,钟 耕

(1.西南大学食品科学学院,重庆 400716;2.西南大学西塔学院,重庆 400715;3.食品科学与工程国家级实验教学示范中心(西南大学),重庆 400716)

乳制品是改善居民膳食结构,提高民族身体素质的重要食品,乳糖(lactose)是乳制品中存在的主要碳水化合物,乳糖经由小肠黏膜上皮细胞绒毛刷状缘分泌的乳糖酶分解为葡萄糖和半乳糖,是供给婴儿所需能量的主要来源[1]。据调查,全世界大约70%的人体内缺乏乳糖酶[2]。乳糖不耐受(lactose intolerance,LI)是由于乳糖酶数量的减少及活性的降低,不能完全消化分解乳中的乳糖而引起以腹胀、腹泻、腹痛为主的一系列临床症状[3]。乳糖不耐受按照病因主要分为三型,第一型为先天性乳糖不耐受,很罕见[4],不作为本文主要研究问题。第二型为原发性(成人型)乳糖不耐受,在临床最为常见,是指随着年龄增长乳糖酶活性自发地逐渐下降而引起的乳糖不耐受[5]。第三型为继发性乳糖不耐受,指多由于感染性腹泻、营养不良等原因,导致小肠粘膜细胞受损而使乳糖酶含量降低,从而对乳糖暂时不耐受[4]。现如今关于解决乳糖不耐受问题的方法,均还有待完善。如食用低(无)乳糖制品,但无法长期满足患者营养需求[6];口服乳糖酶通常需要长期治疗且价格昂贵,且胃内pH等因素均会影响乳糖酶的功效[7];而改变基因又相对复杂且技术不成熟,仍处于试验阶段[8]。如何简单高效地提高乳糖酶活性是现如今需要研究的主要方向。

人体肠道内乳糖酶的主要来源为机体自身合成、有益菌少量合成并分泌,以及摄入外源乳糖酶[9]。乳酸菌作为一种主要的肠道益生菌,能够压制腐败细菌以及肠的腐化,预防便秘和老年性疾病,同时可以防治与抗生素有关的腹泻[10]。其中,双歧杆菌能够改善乳糖的利用,并通过调节肠道菌群平衡来治疗腹泻[11]。另有研究表明,所有双歧杆菌均具有乳糖酶,且活力显著高于其他肠道菌群[9],因此适量补充双歧杆菌可预防乳糖不耐受病症的发生[12]。如何促进益生菌群的生长,成为提高乳糖酶活性及数量,从而缓解乳糖不耐受问题的新思路。

魔芋中的主要成分为一种可溶性半纤维素,即魔芋葡甘聚糖(Konjac Glucomannan,KGM)[13]。KGM是一种不被人体吸收的膳食纤维,具有极低的热量及饱腹感,可以预防肥胖,并具备降血脂的作用[14-15]。有研究指出,KGM可促进乳酸菌等肠道益生菌的生长[16]。另有研究表明,RP-G28(一种特殊的低聚半乳糖)可能是改善乳糖消化和LI症状的有效方法[17],RP-G28与KGM均为水溶性膳食纤维,但未见有关KGM对乳糖代谢作用的研究。本实验参考秦清娟等[16]通过肠道内容物体外厌氧发酵模拟肠道的方法,拟通过提供厌氧条件并调节发酵液pH为7.5左右模拟肠道环境[18]。以KGM及其氧化衍生物-氧化魔芋葡甘聚糖(Oligo-Konjacglucomannan,OKGM)为试验材料,体外发酵法研究其对乳糖的降解作用。通过体外厌氧发酵24 h,从构效(KGM与OKGM)、量效(设置低、中、高剂量)以及时效(不同发酵时间的测定结果)三个方面测定并分析各指标,研究KGM和OKGM对益生菌生长和对乳糖代谢的促进作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清洁级KM小鼠 重庆腾鑫生物技术有限公司,SCXK(军)2012-0011;KGM 重庆康家客食品公司,符合NY/T 494-2010《魔芋粉》;全脂奶粉 雀巢公司生产,配方:生牛乳、乳粉、铁(焦磷酸铁)、维生素D(胆钙化醇)、食品添加剂(磷脂);乳酸菌种 北京川秀科技有限公司提供,丹麦进口,产品标准号:Q/TZCXG 0001;乳糖 合肥博美生物科技有限责任公司;碳酸氢铵、氯化钠 成都市科隆化学品有限公司;碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、氢氧化钠、九水合硫化钠、亚硫酸氢钠水 成都市科龙化工试剂厂;苦味酸 BR,台山市众城化工有限公司;上述试剂除注明外,均为AR;MRS培养基 BR,北京奥博星生物技术有限责任公司;多胨 BR,青岛高科园海博生物技术有限公司;琼脂 BR,福建省绿麒食品胶体有限公司;乳糖酶试剂盒 南京建成生物工程研究所;BCA蛋白浓度测定试剂盒 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

Synergy H1多功能酶标仪 中国香港基因有限公司;Spectrum100红外分光光度计 美国PERKINELMER公司;UV-2450紫外可见光分光光度计 日本SHIMADZU公司;JM-65003电子天平 中国诸暨市超泽衡器设备有限公司;SW-CJ-1FD超净工作台 中国苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;GR60DA自动压力蒸汽灭菌器 中国致微(厦门)仪器有限公司;NDJ-5S旋转粘度计 中国上海越平科学仪器有限公司。

1.2.1 OKGM的制备 参考李斌等[19]的方法,并略有修改:将料液比为1∶4的KGM及异丙醇加入至三口瓶(500 mL)中,搅拌5 min,调pH7.5,反应温度4～5 ℃,滴加体积分数为2.4%的H2O2,30 min内滴加完毕,反应4 h后,经过滤、洗涤,60 ℃低温干燥至恒重,得OKGM。在60 ℃水浴加热搅拌2 h,冷却至室温,用旋转粘度计,检测质量分数为1%的OKGM粘度为1036 mPa·s,质量分数为1%的KGM的粘度为7450 mPa·s。通过滴定法测定氧化度为0.431。分别称取10 mg KGM和OKGM,以KBr压片,傅里叶红外分光光度计上测定,进行光谱分析。

1.2.2 体外厌氧发酵 基础发酵液的配制参考Menke等[20]的方法,配方如下:400 mL H2O、0.1 mL微量元素溶液A(每100 mL溶液A含CaCl2·2H2O 13.2 g、MnCl2·4H2O 10 g、CoCl·6H2O 1 g和FeCl3·6H2O 8 g)、200 mL 碳酸盐缓冲溶液B(每L溶液B 含NH4HCO34 g和NaHCO335 g)、200 mL 磷酸盐缓冲溶液C(每L溶液C含Na2HPO45.7 g、KH2PO46.2 g和MgSO4·7H2O 0.6 g)、1 mL 1.0 g/L刃天青溶液、40 mL还原剂溶液(每100 mL还原剂溶液含NaOH 160 mg、Na2S·9H2O 625 mg)。

参考秦清娟等[16]方法,并作适当调整:在无菌条件下,分别取20只健康KM小鼠回肠、盲肠内容物,迅速装入已灭菌处理的50 mL的带盖离心管中并称重,导入高纯二氧化碳,上盖。加入内容物质量9倍的无菌生理盐水稀释,经振荡分散均匀后用2层纱布过滤,即为回肠及盲肠内容物稀释液。配制基础发酵液,灭菌,等分为16份于各发酵瓶中(160 mL/份),其中12份分别加入不同剂量的KGM或OKGM以及奶粉,另外2份加入乳酸菌和奶粉作为阳性对照组,最后2份只添加奶粉作为阴性对照组(详见表1)。迅速将体积分数10%回肠或盲肠内容物稀释液加入上述各组发酵液中,混合均匀后冲入CO25 s后,立即盖上瓶盖,将其放于37 ℃厌氧发酵箱中发酵,每间隔4 h取样一次,24 h后终止发酵并进行各项指标的测定。

表1 各试验组与对照组设置Table 1 Set of each experimental and control group

1.2.3 发酵液中菌落数的测定 乳酸菌等益生菌合成并分泌的乳糖酶是体内乳糖酶的来源之一,其中双歧杆菌的乳糖酶活性显著高于其他肠道菌群[9]。因此本实验在测定发酵液中乳酸菌数量的基础上,又增加专门针对双歧杆菌数量的测定。因MRS培养基作为乳酸菌基础培养基被广泛应用[21],陈晓蔚等[22]指出改良BBL培养基可选择性培养双歧杆菌并抑制乳酸杆菌生长[22]。因此,本试验采用以上两种培养基(BBL参考陈晓蔚等[22]配制)测定发酵液中的菌落数。参照陈影等[23]的方法,并适当调整如下:分别将上述两种培养基固体粉末与水以一定比例混合,加热煮沸并高温灭菌后待用。将灭菌过的培养基(约10～20 mL)于超净工作台内倒入培养皿中,等待平板冷却凝固。取少量发酵液(0.1 mL)于培养基表面并均匀涂布。于37 ℃恒温培养48 h后,选取菌落数在30～300个之间的平板计数。

1.2.4 发酵液中pH测定 每隔4 h取一次样,参考GB/T 1601-1993《农药pH的测定方法》标准方法测定[24]。

1.2.5 发酵液中乳糖酶活性 按照乳糖酶试剂盒的要求进行操作并计算。

1.2.6 奶粉及发酵液中乳糖含量的测定 参考樊宏等[25]方法,并适当修改为:精确称取1.000 g样品于烧杯中(液体则根据蛋白质含量不同,精确称取10.0～20.0 g样品),用水溶解,移入200 mL容量瓶中并定容。从中精确吸取25.0 mL于100 mL容量瓶,缓慢加入5.0 mL乙酸锌溶液(219 g/L)和5.0 mL亚铁氰化钾溶液(106 g/L),加水定容并混匀。静置30 min后,通过滤纸过滤,待测。同时做空白试验。作乳糖标准曲线,测得乳糖含量线性回归方程为C=4.5608×A+0.0487,结果表明吸光度与浓度呈良好的线性关系(R2为0.9728)。取2.0 mL样品和试剂空白滤液于25 mL比色管,在波长520 nm处测定吸光值,按下式计算乳糖含量:

式中:X,乳糖的含量,g/100 g;C,根据回归方程测得样品中乳糖的含量,mg;M,样品质量,g;V1,经稀释样品定容的体积,mL;V2,沉淀蛋白质时使用的稀释样品的体积,mL;V3,沉淀蛋白质时样品定容的体积,mL;V4,测定时乳糖使用的体积,mL。

1.3 数据处理

数据均采用SPSS分析软件(v23)中单因素ANOVA检验得出平均值、标准差以及显著性分析等,并通过Excel软件(2016)制图。

2 结果与分析

2.1 KGM及OKGM红外光谱分析

分别对样品KGM和OKGM进行红外光谱分析,从图1可见,3406 cm-1处的多糖-OH特征吸收峰、873 cm-1处的表征β-D糖苷键构型的吸收峰、797 cm-1处的吡喃环呼吸振动峰都能明显识别,说明经氧化改性所得的OKGM的主链结构与KGM一致,但1711 cm-1处出现了新的吸收峰,表明氧化形成了羧基(-COOH),结果与李斌等[19]研究结果一致。

图1 KGM和OKGM红外光谱图Fig.1 KGM and OKGM infrared spectra

2.2 发酵液中菌落数的测定

由表2可知,在回肠发酵液中,KGM中、高剂量组和OKGM低、高剂量组的乳酸菌数量均显著高于阴性对照组(P<0.05)。同时双歧杆菌数量测定结果显示,KGM各试验组以及OKGM低、高剂量组的菌落数量均显著高于阴性对照组(P<0.05)。在盲肠发酵液中,KGM、OKGM各试验组和阳性对照组的乳酸菌数量均显著高于阴性对照组(P<0.05),同样的结果也可以在双歧杆菌数量测定中观察到。此外在回肠和盲肠发酵液中,对比KGM与OKGM两组结果发现,相同剂量的KGM和OKGM各组间数据几乎均无显著性差异(P>0.05)。以上结果表明,KGM和OKGM对乳酸菌生长增殖均具有良好的促进作用,与秦清娟等[16]的研究结论一致:KGM对乳酸菌等肠道有益菌有明显的促进增殖作用。

表2 发酵液中微生物数量Table 2 Microbial quantities in anaerobic fermentation

2.3 发酵液pH的变化

由图2～图5可知,经24 h体外厌氧发酵,回肠发酵液组与盲肠发酵液组pH测定结果呈现较为相似的现象:整体上,各组pH在24 h内呈下降趋势,其中阳性对照组在两类发酵液组别中均下降最多(回肠发酵液阳性对照组从7.5降至4.3,盲肠发酵液阳性对照组从7.5降至4.2);0～12 h,各组pH下降速度较快,且在12 h时同一类发酵液组间呈现较为明显的差异:KGM高剂量组、阳性对照组12 h的pH均显著低于其阴性对照组(P<0.05);12～24 h,各组pH均下降至最低点(回肠发酵液组平均降至4.4左右,盲肠发酵液组平均降至4.3左右)。比较可知,回肠发酵液和盲肠发酵液的KGM高剂量组pH在12 h均显著低于其阴性对照组(P<0.05),但两类发酵液的OKGM各剂量组在24 h时均与其阴性对照组无显著性差异(P>0.05)。可能的原因为,发酵液pH与其中微生物活性密切相关[26],据研究指出KGM可以促进乳酸菌等肠道益生菌的增殖[16],从而可能对发酵液pH造成明显的影响,但KGM的氧化改性产物OKGM对发酵液pH的影响还未见相关研究报道,也值得后续深入研究。

图2 KGM各剂量组及对照组回肠发酵液不同时段pH的比较Fig.2 Comparison of pH in each KGM group and control groupin ileum fermentation broths at different time

图3 OKGM各剂量组及对照组回肠发酵液不同时段pH的比较Fig.3 Comparison of pH in each OKGM group and controlgroup in ileum fermentation broths at different time

图4 KGM各剂量组及对照组盲肠发酵液不同时段pH的比较Fig.4 Comparison of pH in each KGM group and controlgroup in cecum fermentation broths at different time

图5 OKGM各剂量组及对照组盲肠发酵液不同时段pH的比较Fig.5 Comparison of pH in each OKGM group and controlgroup in cecum fermentation broths at different time

2.4 发酵液中乳糖酶活性的测定

由表3可知,在8、12 h各组回肠发酵液中,KGM高剂量组、OKGM各剂量组和阳性对照组的乳糖酶活性均显著高于阴性对照组(P<0.05)。在盲肠发酵液中,OKGM高剂量组和阳性对照组8 h的乳糖酶活性显著高于阴性对照组(P<0.05),12 h只有OKGM中、高剂量组的乳糖酶活性显著高于阴性对照组(P<0.05)。以上现象说明KGM和OKGM对发酵过程中乳糖酶活性具有促进作用,原因可能为乳糖酶活性随着肠道内厌氧菌数量(肠道厌氧菌群主要为类杆菌、双歧杆菌和乳杆菌)的增加而增强[27],且KGM可促进双歧杆菌、乳杆菌等肠道有益菌的生长[16],进而可能提高了乳糖酶活性。此外,相同剂量下OKGM组的乳糖酶活性整体较KGM组高。此现象可能因为KGM经氧化后分子链产生解聚[28],生成低分子甘露聚糖,更容易被微生物利用,此现象与Li等[29]研究结果相似:肠道微生物可以降解利用琼胶和卡拉胶寡糖,但对高分子量琼胶和卡拉胶的降解能力很低。

表3 8、12 h发酵液中各组乳糖酶活性Table 3 Lactase activity in 8 and 12

2.5 发酵液中乳糖含量的变化

由图6、图7可知,回肠发酵液各组在24 h内,乳糖含量整体呈现下降趋势。4 h各组间乳糖含量开始呈现显著性差异:KGM低剂量组、OKGM各剂量组和阳性对照组的乳糖含量显著低于阴性对照组(P<0.05),提示KGM和OKGM可能有效加快乳糖代谢进程。4～24 h,各组乳糖含量继续下降并在24 h降至最低值,其中,KGM中、高剂量组和OKGM各剂量组24 h乳糖含量均显著低于阴性对照组(P<0.05)。

图6 KGM各剂量组及对照组回肠发酵液不同时段乳糖含量的比较Fig.6 Comparison of lactose content in each KGM groupand control group in ileum fermentation broths at different time

图7 OKGM各剂量组及对照组回肠发酵液不同时段乳糖含量的比较Fig.7 Comparison of lactose content in each OKGM groupand control group in ileum fermentation broths at different time

由图8、图9可知,体外厌氧发酵24 h,各组盲肠发酵液的乳糖含量也呈下降趋势。4 h各试验组和阳性对照组的乳糖含量均显著低于阴性对照组(P<0.05),且KGM中剂量组和OKGM中、高剂量组的乳糖含量均显著低于阳性对照组的乳糖含量(P<0.05),提示KGM和OKGM可能有效加快乳糖代谢过程。4～24 h内,各组乳糖含量较为平稳地降至最终值,且KGM低、中剂量组和OKGM中、高剂量组以及阳性对照组的24 h乳糖含量均显著低于阴性对照组(P<0.05)。

图8 KGM各剂量组及对照组盲肠发酵液不同时段乳糖含量的比较Fig.8 Comparison of lactose content in each KGM groupand control group in cecum fermentation broths at different time

图9 OKGM各剂量组及对照组盲肠发酵液不同时段乳糖含量的比较Fig.9 Comparison of lactose content in each OKGM groupand control group in cecum fermentation broths at different time

以上结果说明,KGM和OKGM可有效降低经发酵奶粉的乳糖含量,4h即有明显效果,表明对乳糖代谢具有明显的促进作用。原因可能为肠道内乳酸菌等肠道益生菌含有乳糖酶,是体内乳糖酶的来源之一[9]。而KGM被证明可以促进此类肠道益生菌的生长繁殖[16],且由于厌氧菌数量越高(研究表明肠道内厌氧菌群最多的为类杆菌、双歧杆菌和乳杆菌),肠道内乳糖酶活性越大[27],从而可能使得乳糖含量明显降低。

3 结论

实验结果显示,KGM与OKGM对乳酸菌有明显的增殖作用:在回肠发酵液中,KGM中、高剂量组和OKGM低、高剂量组的乳酸菌数量均显著高于阴性对照组(P<0.05);在盲肠发酵液中,KGM、OKGM各试验组的乳酸菌数量均显著高于阴性对照组(P<0.05)。同时,KGM与OKGM可显著提高乳糖酶活性:8、12 h回肠发酵液中,KGM高剂量组、OKGM各剂量组的乳糖酶活性均显著高于阴性对照组(P<0.05);盲肠发酵液中,OKGM高剂量组8和12 h的乳糖酶活性显著高于阴性对照组(P<0.05)。此外,KGM和OKGM对乳糖代谢具有显著促进作用:发酵4 h KGM低剂量组、OKGM各剂量组的回肠发酵液中乳糖含量显著低于阴性对照组(P<0.05),同时各试验组的盲肠发酵液中乳糖含量均显著低于阴性对照组(P<0.05),且其中KGM中剂量组和OKGM中、高剂量组结果也显著低于阳性对照组(P<0.05),提示KGM和OKGM可有效加快乳糖代谢;发酵24 h后KGM中、高剂量组和OKGM各剂量组的回肠发酵液中乳糖含量均显著低于阴性对照组(P<0.05),且KGM低、中剂量组和OKGM中、高剂量组的24 h盲肠发酵液中乳糖含量均显著低于阴性对照组(P<0.05)。综上所述,添加了KGM或OKGM的奶粉可促进人体肠道内乳酸菌的生长,同时可促进乳糖的代谢,即明显提高乳糖酶活性,加快乳糖的分解,并有效降低乳糖含量。