低氧诱导大鼠脂肪干细胞旁分泌因子对子痫前期大鼠心肌损伤的保护作用

项晓觉 林梅瑟 孙腾飞 吴静 陈鹏鹏 陈克龙

子痫前期是威胁孕产妇生命的常见病症，是子痫的前兆，主要表现为妊娠中后期血压升高、蛋白尿等[1-2]。由于子痫前期的症状不明显，诊治不及时可导致子痫发作。子痫前期可导致多种并发症，造成心、肺、脑等器官损伤[3-4]。有研究表明子痫前期能够导致孕妇的心脏后负荷增加，从而引起冠状动脉痉挛、间质水肿、出血、心肌细胞坏死引起心肌缺血缺氧、收缩力下降等[5]。因此，在子痫前期通过敏感指标监测心肌损伤情况十分重要。目前除了几种常见的衡量心肌损伤的标志物外，钙蛋白酶在维持肌肉的正常生理状态中也发挥了重要的作用[6]。

脂肪干细胞主要来源于脂肪组织，具有良好的自我复制和多向分化潜能，且分离简便、容易获得，近年成为干细胞研究领域研究的热点。有研究证实干细胞旁分泌作用可以有助于细胞的修复，治疗心肌梗死[7-8]。国内研究发现，低氧状态下更有利于人脂肪干细胞的旁分泌，并可发挥多种生物学功能。目前关于干细胞旁分泌作用在子痫前期的心肌保护中的作用鲜有报道。本研究探讨心肌损伤标志物及钙蛋白酶在子痫前期大鼠中的变化及低氧诱导大鼠脂肪干细胞旁分泌对大鼠心肌损伤的保护作用，现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 选择SPF 级成年SD 大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）52 只，雌性31 只，平均体重（212.12±23.16）g；雄性21 只，平均体重（245.22±28.11）g。将21 只雌性大鼠与21 只雄性大鼠同笼饲养，每天早晨对雌鼠行阴道分泌物镜检，发现精子为妊娠第1 天，将得到的怀孕的雌鼠单独分笼饲养。本研究方案经本校/本单位实验动物伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器 亚硝基左旋精氨酸甲酯（L-nitro arginine methylester，L-NAME，大连美伦生物技术有限公司MB3015），肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）检测试剂盒（ml059533）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒（上海酶联生物ml059174）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）检测试剂盒（ml059334），肌钙蛋白T（troponin T，cTnT）检测试剂盒（ml059510）、心脏脂肪酸结合蛋白（heart-type fatty acid-binding protein，H-FABP）检测试剂盒（ml059745）均购自上海酶联生物公司，钙蛋白酶活性检测试剂盒（美国Sigma，MAK228），CD73（551123）、CD90（554898）、CD14（561711）、CD19（741141）、CD34（560710）及流式细胞仪均购自美国BD 公司，Trizol（美国Thermo Fisher公司，15596026），TB Green Premix Ex TaqTM（日本TAKARA 公司，RR420Q），AU5800 全自动生化分析仪（美国Beckman 公司），CFX96 荧光定量PCR 仪（美国Biorad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 脂肪干细胞的分离培养[9]采用2%的戊巴比妥对10 只未怀孕的雌鼠麻醉，取腹股沟韧带皮下脂肪组织，用Ⅰ型胶原酶处理1h，800g 离心弃上清液，将细胞沉淀放入含10%胎牛血清的DF12 培养基中，置于37℃、5%的CO2中进行培养。平均3d 换一次液，每次待细胞密度达到80%用0.25%的胰酶消化传代，直到获得第3 代脂肪干细胞，留存备用。

1.3.2 脂肪干细胞形态观察和表面标志物鉴定 用光学显微镜观察第3 代脂肪干细胞的形态，取细胞数量为（1～2）×106个细胞混悬于磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）中，800g 离心参数3min，弃上清液，重新加入500μl PBS 混悬。按照抗体说明书 的 步 骤 和 要 求 加 入CD73、CD90、CD14、CD19、CD34 抗体，4℃避光孵育45min，流式细胞仪检测。细胞流速中等，根据前向角散射（forward scatter，FSC）和侧向角散射（side scatte，SSC）选择符合特征的细胞群，根据图形调整电压使图形易于观察，便于结果更好展示。

1.3.3 低氧旁分泌上清液的制作和细胞因子的测定取第3 代脂肪干细胞，将其分别培养在低氧体积分数下（低氧诱导组）和正常氧体积分数下（正常氧体积组）。低氧诱导组：将脂肪干细胞培养在氧气浓度10%，无血清的DF12 培养基中，培养24h 后，吸取培养上清液，800g 离心弃残渣备用；正常氧体积组：将脂肪干细胞培养在氧浓度与空气相同的培养基中，方法同前。采用ELISA 法分别测定上清液中表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF，美国Sigma 公司，RAB0149），胰岛素样生长因子（insulinlike growth factor，IGF，美国Sigma 公司，RAB0228），碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor bFGF，英国Abcam 公司，ab99979），转化生长因子α（transforming growth factor α，TGF-α，美国Sigma 公司，RAB0459）的含量。

1.3.4 子痫前期SD 孕鼠模型构建[10]和干预方法采用随机数字表法将21 只孕鼠分为3 组，造模+治疗组、造模组和对照组，每组7 只。自妊娠第12天开始，造模+治疗组和造模组皮下注射L-NAME（125mg·kg-1·d-1），对照组注射等体积的生理盐水，共7d。妊娠第10 天开始，用动物无创血压测试仪（成都泰盟科技有限公司）测量尾动脉的收缩压，每天早、中、晚各测1 次（每个时间点测量血压均需重复3 次，取平均值作为该时间点血压的估计值），取平均值作为当天血压的估计值，测量血压时务必确保各组孕鼠在相同的时间相同的环境下进行测量，以减少误差。分别于妊娠第10、20 天收集两组孕鼠24h 尿量，以磺基水杨酸比浊定法测定尿蛋白浓度。造模成功标准：测得造模+治疗组和造模组的血压和尿蛋白的含量超出对照组，且升高20%以上。造模成功后，造模+治疗组通过尾静脉注射脂肪干细胞旁分泌上清液1ml，造模组和对照组注射生理盐水1ml，均连续注射7d。

1.3.5 心肌损伤标志物的测定 于无菌条件下，剖开3 组孕鼠，取出心脏，破碎心肌组织，离心取上清液，用全自动生化仪检测CK-MB、LDH、AST 水平，ELISA 试剂盒检测cTnT 和H-FABP 水平。

1.3.6 钙蛋白酶活性和相关基因的表达量的测定将破碎心肌组织离心取上清液，按照钙蛋白酶检测试剂盒的要求进行实验操作，测定3 组钙蛋白酶的活性。用Trizol 提取心肌组织的RNA。取1μgRNA按照逆转录酶试剂盒说明书指导进行逆转录反应，得到cDNA。调整cDNA 浓度，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明，使用bio-rad CFX96 荧光定量PCR 仪进行mRNA 水平的测定。反应条件为：95℃5min；95℃10s，55℃30s，40 个循环。引物序列见表1。结果统计：ΔCt1=每个样本的目的基因循环数（Ct1 值）- 其对应的内参基因循环数（Ct2 值）；ΔCt2=每组中所有样本ΔCt1 的平均数；2-ΔΔCt2 即为两组基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.3.7 3 组孕鼠心肌组织HE 染色 将3 组孕鼠心肌组织置于4%的多聚甲醛中4℃过夜。切成2mm左右的立方体小块，流水冲洗组织中的多聚甲醛10h。分别置于50%、60%、80%、90%、100%乙醇中浸泡40min，二甲苯浸泡20min，浸于液体石蜡中过夜。使用石蜡包埋机对组织块进行包埋，包埋后使用切片机切成6mm 的含心肌组织的石蜡薄片，贴于载玻片上室温风干过夜。染色前先脱蜡，然后依次用苏木素、酸性乙醇、氨水、伊红进行染色，最后用树胶封片风干。显微镜下观察。

1.4 统计学处理 应用SPSS19.0 统计软件，统计图表采用Graphpad Prism 5 进行绘制。符合正态分布的计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两组间均数比较采用独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂肪干细胞在光学显微镜下的形态和流式细胞仪鉴定结果 见图1。

图1 脂肪干细胞在光学显微镜下的形态（A）和流式细胞仪鉴定的结果（B-F）

表2 脂肪干细胞旁分泌上清液中细胞因子水平比较

由图1 可见，脂肪干细胞分离，经过2 次传代后细胞呈纺锤形，贴壁生长，在培养瓶底部表现为旋涡式的分布（图1A）。流式细胞仪鉴定CD73（图1B）、CD90（图1C）呈阳性，CD14（图1D）、CD19（图1E）、CD34（图1F）呈阴性。

2.2 低氧诱导组、正常氧体积组脂肪干细胞旁分泌上清液中细胞因子水平比较 见表2。

由表2 可见，低氧诱导组的上清液中EGF、IGF、bFGF、TGF-α 水平均高于正常氧体积组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3 造模后3 组孕鼠一般资料比较 见表3。

由表3 可见，造模成功后，造模+治疗组和造模组血压和尿蛋白均高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。造模+治疗组与造模组血压、尿蛋白差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.4 经干预后3 组孕鼠心肌标志物水平的比较见表4。

由表4 可见，造模组和造模+治疗组的CK-MB、LDH、cTnT、AST、H-FABP 水平均高于对照组（P＜0.05 或0.01），同时，造模+治疗组的CK-MB、LDH、cTnT、AST、H-FABP 水平均低于造模组（均P＜0.05）。

2.5 经干预后3 组孕鼠心肌组织中钙蛋白酶的活性以及相关基因表达量比较 见图2、3。

表3 造模后3 组孕鼠一般资料比较

由图2、3 可见，造模+治疗组及造模组钙蛋白酶活性高于对照组，造模组钙蛋白酶活性高于造模+治疗组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。造模+治疗组及造模组Capn1 高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；造模组Capn1 高于造模+治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）。3 组Capn2 和Capn3 基因的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.6 3 组孕鼠心肌HE 染色结果比较 见图4。

由图4 可见，对照组心肌组织未见明显的病理形态改变，横纹较清晰；造模组孕鼠心肌组织心肌间质有大量细胞明显肿胀，部分心肌细胞变性、坏死，肌束排列不整齐；造模+治疗组肌横纹较清晰，细胞坏死程度较轻。

图2 经干预后3 组孕鼠心肌组织中钙蛋白酶的活性比较（与对照组比较，*P＜0.05；与造模组比较，△P＜0.05）

图3 经干预后3 组孕鼠钙蛋白酶相关基因的表达量比较（与对照组比较，*P＜0.05；与造模组比较，△P＜0.05）

图4 3 组孕鼠心肌HE 染色结果比较（A：造模+治疗组；B：造模组；C：对照组。箭头指示处为幼细胞坏死，×200）

3 讨论

子痫前期症状不典型，常伴有恶心、妊娠高血压等常见的并发症，对诊断具有一定的影响。如果误诊或治疗不及时，会导致子痫、肾功能减退、胎盘早剥等并发症，更甚者产后出血导致母婴的病死率升高[11-12]。子痫前期一个显著的特点是出现高血压，影响心血管系统[13-14]。有研究显示，子痫前期导致的子痫性心脏病主要表现为左心衰竭与心肌损伤[15]。还有研究报道，不同病情严重程度子痫前期患者心脏损伤程度存在差异, 伴有严重症状的子痫前期患者心肌损伤水平更显著[16]。

目前衡量心脏功能的检测指标主要是通过对心肌酶的联合检测实现的。血清CK-MB 测定的最重要意义在于诊断急性心肌梗死，临床上常以CK-MB超过CK 总活性的3 倍（离子交换柱层析法）或10倍（免疫抑制法）作为急性心肌梗死的诊断依据。各种类型的心脏手术后可引起血清CK-MB 活性增强，在并发术间或术后心肌梗死时升高更为显著[17-18]。LDH 几乎存在于所有组织中，以肝、肾、心肌、骨骼肌、胰腺和肺中为最多。这些组织中的LDH 活力较血清中高得多。所以当少量组织坏死时，该酶即释放入血而使其他血液中的活力升高。测定此酶常用于对心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断[19-20]。AST 升高常见于急性心肌梗死，在发病后6～8h AST 开始上升，18～24h 后达高峰[21]。cTnT 是围手术期心肌梗死的敏感和特异的标志物，能够鉴别出没有达到常规围手术期心肌梗死判断标准的微小的围手术期心肌损伤[22]。H-FABP 大量存在于心肌细胞中，是一种心肌缺血的高敏早期标志物，其主要功能是促进细胞内的长链脂肪酸运输，不仅能够作为急性心肌梗死早期标志物，还是理想的心肌梗死复发诊断标志物[23-24]。本研究通过对子痫前期大鼠的5种心肌标志物检测发现，子痫前期孕鼠较正常孕鼠的CK-MB、LDH、cTnT、AST、H-FABP 水平高，证实了子痫前期对心肌的损伤作用。同时本研究还检测了钙蛋白酶的表达，因为多项研究表明钙蛋白酶的升高与心肌损伤程度呈正相关[25-26]，本研究也发现造模组的钙蛋白酶活性高于对照组。同时研究表达钙蛋白酶的3 种基因，即Capn1，Capn2，Capn3，3 种基因均表达钙蛋白酶，但是不同基因表达的钙蛋白酶在功能上有不同的作用[27-28]。本研究发现，Capn1在子痫前期中有较高的表达，表明子痫前期心肌的损伤可能是由钙蛋白酶对心肌纤维的破坏导致。

脂肪干细胞属于间充质干细胞，由于其具有免疫原性、定向分化、较强的增殖能力等优势，目前被用到多种疾病的治疗。有多项研究表明干细胞在治疗细胞损伤和伤口修复中是依靠旁分泌的作用实现刺激细胞增殖和迁移，保护免收外界的氧化损伤来实现的，在其分泌的溶液中被检测到含有EGF、IGF、bFGF、TGF-α 等有利于细胞生长、分化的细胞因子，尤其是在低氧、低营养等极端条件下旁分泌作用还会加强[29-30]。本研究也证实经过低氧诱导后的脂肪干细胞旁分泌上清液中EGF、IGF，bFGF 和TGF-α 水平均高于正常培养的水平。因为EGF、IGF、bFGF 和TGF-α 均可以促进细胞的增殖和迁移，加速损伤的快速修复，作为血管生长因子，促进创伤愈合与组织修复，促进组织再生，还具有抗氧化的作用等。所以低氧诱导的旁分泌上清液对心肌损伤的修复效果更佳。通过HE 染色病理学观察也发现造模组大鼠心肌组织心肌间质有大量细胞明显肿胀，部分心肌细胞变性、坏死，肌束排列不整齐；造模+治疗组肌束排列较整齐，细胞坏死程度较轻。同时，造模+ 治疗组的CK-MB、LDH、cTnT、AST、H-FABP 水平低于造模组。对3 组钙蛋白酶活性和Capn1 基因的表达量分析，造模组高于造模+治疗组，造模+治疗组高于对照组。从体内蛋白和基因水平表明干细胞旁分泌上清液对心肌组织起到了一定的保护作用，但是还不能完全恢复到与对照组相当的水平，因此如果应用于治疗中需要配合其他的药物可能效果会更好。

综上所述，低氧诱导的脂肪干细胞旁分泌因子能够减轻子痫前期所致的心肌损伤。