胃癌间质干细胞活化Wnt/β-catenin信号通路促进胃癌细胞增殖及迁移作用的探讨*

尹磊，刘伟，胡玉燕，蒋涵，钱晖(江苏大学医学院&检验医学江苏省重点实验室，江苏镇江 212013)

间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是肿瘤微环境的重要组成部分，可通过直接接触或旁分泌作用促进肿瘤的进展。2009年，本课题组首先从人胃癌组织中分离培养出胃癌MSCs(gastric-cancer-derived MSCs，GC-MSCs)[1]，并发现GC-MSCs高表达Yes相关蛋白1(Yes-associated protein1,YAP1)可促进胃癌细胞增殖、迁移、侵袭，诱导内皮细胞小管形成[2]。此外，GC-MSCs可诱导CD4+T细胞迁移、分化，并促进胃癌进展[3]。Wnt/β-catenin信号在胃癌中常异常活化，可促进胃癌进展，是胃癌治疗的重要靶点之一。Yang等[4]发现，长链非编码RNA LINC01133可吸附miR-106a-3p，拮抗Wnt/β-catenin信号通路，抑制胃癌生长和转移。目前尚不清楚GC-MSCs能否活化Wnt/β-catenin信号通路，进而影响胃癌的进展。本研究旨在探讨GC-MSCs对胃癌细胞增殖、迁移及Wnt/β-catenin信号通路的影响，以期为胃癌治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1细胞、试剂与仪器 人胃癌细胞系HGC-27购自中国科学院上海细胞库；RPMI 1640培养基、Alexa Fluor 555标记山羊抗兔多克隆IgG(美国Invitrogen公司)；胎牛血清、L-DMEM培养基(美国Gibco公司)；成骨、成脂诱导培养试剂盒(美国Cyagen公司)；兔抗人β-catenin抗体、兔抗人CD44抗体(美国Cell Signaling Technolog公司)；兔抗人CyclinD3抗体、兔抗人β-actin抗体(美国Bioworld Technology公司)；山羊抗兔多克隆IgG抗体(上海康成生物公司)；Wnt/β-catenin信号抑制剂ICG001(美国Selleck公司)；结晶紫、Hoechst 33342染料(美国Sigma公司)；Tirton X-100、多聚甲醛(上海国药集团)；RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF(美国Vazyme公司)；BCA蛋白质检测试剂盒(北京康为世纪公司)；牛血清清蛋白(BSA，上海罗氏制药公司)。0.22 μm滤器、PVDF膜(美国Millipore公司)；Transwell迁移小室(美国Corning公司)；Loading buffer、细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；ECL化学发光检测系统、DeltaVisionTMElite显微镜(美国GE公司)；倒置显微镜(德国Leica公司)。

1.2GC-MSCs原代培养 收集2018年9月至2019年9月于镇江市第一人民医院普外科就诊并行手术治疗的胃癌患者7例，男4例，女3例，年龄65～82岁，中位年龄76岁。纳入标准：病理经组织学明确诊断为胃癌；术前未行放、化疗或其他抗肿瘤治疗；未并发其他系统严重疾患。排除标准：近半年使用免疫抑制剂或激素类药物患者；合并严重脏器功能不全者。本研究经江苏大学伦理委员会批准(批号：2012258)，患者知情同意。按本团队已建立的方法体外分离培养GC-MSCs[1]，即新鲜胃癌组织在无菌环境下剪切成1～3 mm3的组织块，添加L-DMEM培养液(L-DMEM培养基加10%胎牛血清)于37 ℃、5% CO2条件下培养，每3天换1次液。当贴壁的GC-MSCs呈旋涡状生长时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后传代培养，取第3～5代的GC-MSCs用于后续实验。

1.3GC-MSC成骨分化 取第3代GC-MSCs以1.5×105/孔的细胞密度接种于预先包被明胶(0.1%)的6孔细胞培养板，加入L-DMEM培养液培养，当GC-MSC融合度达70%时，更换为成骨诱导培养基培养，每3天换1次液，诱导14～20 d；待胞中出现大量钙结节后，用4%中性甲醛溶液固定30 min，茜素红S染色5 min，倒置显微镜下观察，成骨细胞含钙可被染成橘红色。

1.4GC-MSC成脂分化 取第3代GC-MSCs以1.5×105/孔的细胞密度接种于6孔细胞培养板，加入L-DMEM培养液培养，每3天换1次液，当GC-MSC融合度达100%时，更换为成脂诱导A液培养；A液诱导3 d后，更换成脂诱导B液培养24 h；A液及B液交替诱导4～5次后(16～20 d)，B液维持培养3～6 d，每3天换1次液，光学显微镜下(×40)细胞中可见棕黄色脂滴时，诱导分化结束；4%中性甲醛溶液固定30 min；油红O染液染色30 min；倒置显微镜下观察，脂肪细胞中的脂滴可被染成红棕色。

1.5GC-MSC上清收集 取第3～5代生长良好的GC-MSCs，加入L-DMEM培养液培养48 h后，收集细胞上清，1 000×g离心10 min，0.22 μm滤器过滤后，置于-80 ℃冻存。

1.6克隆形成试验 取HGC-27细胞以2×103/孔的细胞密度接种于6孔细胞培养板，常规培养24 h后，实验设为Control组(L-DMEM培养液)、GC-MSC组(GC-MSC上清)、GC-MSC+ICG001组(GC-MSC上清及20 μmol/L ICG001)处理24 h，更换为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基继续培养10 d；4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色15 min，拍照，以肉眼可见的细胞集落为单个克隆。

1.7Transwell迁移试验 取生长状态良好的HGC-27细胞以2×105/孔的细胞密度接种于6孔细胞培养板，按照1.6方法设为Control组、GC-MSC组、GC-MSC+ICG001组3组，经2.5 g/L胰蛋白酶消化后，重悬于RPMI 1640培养基；取200 μL细胞悬液(含8×104个细胞)加入Transwell上室，下室加入600 μL RPMI 1640培养液，置于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h；棉签拭去上室上表面未迁移的细胞，40 g/L多聚甲醛固定上室下表面的细胞30 min，结晶紫染色15 min；倒置显微镜下观察，发生迁移的细胞可被染成蓝色，随机选取6个视野拍照并计数。

1.8免疫荧光染色 无菌环境下取细胞爬片置于24孔细胞培养板中，以2×104/孔的细胞密度接种HGC-27细胞，细胞分组、处理同1.6；4 ℃预冷的PBS洗涤2次，加入40 g/L多聚甲醛溶液室温固定30 min；4 ℃预冷的PBS洗涤3次，每次5 min；加入0.1% Tirton X-100破膜10 min，4 ℃预冷的PBS洗涤3次，每次5 min；50 mg/mL BSA溶液封闭30 min后，加入50 mg/mL BSA溶液稀释的兔抗人β-catenin抗体(1∶100稀释)4 ℃温育12 h；用4 ℃预冷的PBS洗涤4次，每次5 min；加入PBS稀释的Alexa Fluor 555标记山羊抗兔多克隆IgG抗体(1∶250稀释)，37 ℃避光温育40 min；避光下PBS洗涤5次，每次5 min；室温避光下Hoechst 33342染料(1∶300稀释)染核5 min，PBS洗涤2次，每次5 min；取出细胞爬片，封片，DeltaVisionTMElite显微镜下拍摄(×600)，以红色荧光表示为β-catenin表达，蓝色表示为胞核。

1.9western blot HGC-27细胞种板、分组、处理同1.5；3组细胞经蛋白裂解液(100 μL RIPA裂解液加1 μL PMSF)冰上裂解45 min；12 000×g离心取上清，BCA法测定蛋白质浓度；加入蛋白质上清体积1/3的Loading buffer，混匀，沸水煮10 min，分装。配制12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯凝胶(SDS-PAGE)，蛋白质上样(100 μg)，80 V电泳直至目的蛋白质完全分离，350 mA恒流转膜75 min；PVDF膜置于50 mg/mL脱脂奶粉中封闭1.5 h，加入50 mg/mL BSA稀释的兔抗人β-catenin抗体、兔抗人CD44抗体(均为1∶800稀释)，兔抗人CyclinD3抗体(1∶500稀释)、兔抗人β-actin抗体(1∶2 000稀释)，4 ℃温育过夜；1×TBST溶液洗涤6次，每次5 min；1×TBST溶液稀释的山羊抗兔多克隆IgG抗体(1∶2 000稀释)37 ℃温育45 min；1×TBST溶液洗涤6次，每次5 min；采用ECL化学发光检测系统曝光、分析。

2 结果

2.1GC-MSCs的鉴定 人胃癌组织培养10 d后，可见长梭形的GC-MSCs贴壁生长(图1A)。GC-MSCs经成骨诱导培养后，可见橘红色的成骨细胞，提示GC-MSCs具备成骨分化潜能(图1B)。GC-MSCs经成脂诱导培养后，胞内可见红棕色脂肪滴，表明GC-MSCs具备成脂分化潜能(图1C)。

注：A，GC-MSCs的形态(×40)；B，GC-MSCs成骨诱导分化(×100)；C，GC-MSCs成脂诱导分化(×200)。

图1 GC-MSCs的光学显微镜下鉴定结果

2.2GC-MSCs促进胃癌细胞HGC-27增殖、迁移并活化Wnt/β-catenin信号通路 克隆形成试验结果显示，GC-MSC上清诱导HGC-27细胞增殖，其形成的细胞克隆数[(203.700±8.762)个]显著高于Control组[(33.670±1.856))个]，差异有统计学意义(t=18.98，P<0.01)。见图2A。Transwell迁移试验结果表明，GC-MSC组[(349.700±7.881)个]迁移细胞数较Control组[(145.000±3.712)个]显著增多(t=23.46，P<0.01)，见图2B。GC-MSC上清可诱导HGC-27胞核高表达β-catenin蛋白(图2C)，并促进Wnt/β-catenin信号通路下游蛋白CD44及CyclinD3表达(图2D)。

注：GC-MSC上清处理HGC-27细胞；A，克隆形成试验检测细胞增殖；B，Transwell迁移试验检测细胞迁移(×100)；C，免疫荧光染色检测HGC-27细胞β-catenin的表达(×600)；D，western blot检测HGC-27细胞β-catenin、CD44及CyclinD3蛋白的表达。

图2 GC-MSCs促进HGC-27细胞增殖、迁移并活化Wnt/β-catenin信号通路

2.3GC-MSCs活化Wnt/β-catenin信号通路促进HGC-27增殖、迁移 结果显示，Wnt/β-catenin信号通路抑制剂ICG001可抑制GC-MSC上清诱导的HGC-27细胞β-catenin核输入(图3A)及CD44、CyclinD3(图3B)的高表达。与GC-MSC组[(203.000±3.606)个]相比，GC-MSC+ICG001组HGC-27细胞增殖形成的克隆数[(70.667±2.603)个]显著减少(q=39.24，P<0.01)，见图3C。此外，GC-MSC+ICG001组迁移细胞数[(166.000±3.215)个]较GC-MSC组[(352.700±4.096)个]显著降低(q=47.73，P<0.01)，见图3D。

注：GC-MSCs上清单独或联合Wnt/β-catenin信号通路抑制剂ICG001(20 μmol/L)处理HGC-27细胞;A，免疫荧光染色检测HGC-27细胞β-catenin的表达(×600)；B，western blot检测HGC-27细胞β-catenin、CD44及CyclinD3蛋白的表达；C，克隆形成试验检测HGC-27细胞增殖；D，Transwell迁移试验检测HGC-27细胞迁移(×100)。

图3 GC-MSCs激活Wnt/β-catenin信号通路促进HGC-27增殖、迁移

3 讨论

MSCs可自发地向肿瘤部位募集，参与肿瘤微环境的构成。MSCs迁移至肿瘤微环境后可与肿瘤微环境中的其他非肿瘤细胞相互作用，诱导非肿瘤细胞向促瘤表型转化，促进肿瘤生长、转移、复发、耐药，是肿瘤治疗的重要靶点之一[5]。GC-MSCs可促进胃癌生长、转移，但GC-MSCs促进胃癌进展的机制目前尚不清楚。Wang等[6]发现，GC-MSC上清可抑制TH17细胞增殖，诱导Treg细胞分化，破坏Treg/TH17细胞间的平衡，诱导上皮间质化(EMT)转化，促进胃癌肝转移。Sun等[7]证实，GC-MSC上清中富含IL-15,可诱导CD4+T细胞信号转导与转录激活子5(signal transducer and activator of transcription,STAT5)表达，促进胃癌进展。本研究发现，GC-MSC上清可促进胃癌细胞增殖、迁移。以上提示GC-MSCs可通过旁分泌作用促进胃癌进展。

Wnt/β-catenin信号通路在胃癌中异常活化，可促进胃癌生长、转移[4]。旁分泌是Wnt/β-catenin信号通路活化的主要方式之一。我们推测GC-MSCs可通过旁分泌作用，活化胃癌Wnt/β-catenin信号通路，促进胃癌进展。本研究发现，GC-MSCs诱导HGC-27细胞β-catenin蛋白及Wnt/β-catenin信号通路下游蛋白CD44及CyclinD3表达。Wnt/β-catenin信号通路抑制剂ICG001可抑制GC-MSCs对HGC-27细胞的促增殖和促迁移作用。

目前尚不清楚GC-MSCs是如何活化Wnt/β-catenin信号通路而促进胃癌进展。可能的机制为：(1)MSCs相比非肿瘤细胞其β-catenin表达水平更高，β-catenin可经微囊泡递送至肿瘤细胞内[8]，与T细胞因子/淋巴增强因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)相互作用，诱导下游分子c-myc、金属基质蛋白酶表达，促进胃癌进展；(2)GC-MSCs可分泌Wnt1、Wnt5a、Wnt3a等到上清液中，这些分子可与肿瘤细胞表面的Wnt受体相互作用，活化Wnt/β-catenin信号；(3)GC-MSCs可分泌一些非编码RNA如miRNA-25，抑制Wnt/β-catenin通路拮抗基因DKK3的表达，活化Wnt信号。未来，可通过调控GC-MSC Wnt/β-catenin通路相关分子的表达，拮抗胃癌Wnt/β-catenin通路,从而抑制胃癌进展。