MELK mRNA表达水平在非小细胞肺癌患者中的预后价值*

石旦,徐斌,蒋敬庭(苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心，江苏省肿瘤免疫治疗工程技术研究中心，苏州大学细胞治疗研究院，江苏常州213003)

目前已有多种针对非小细胞肺癌(NSCLC)特别是晚期NSCLC的分子靶向药物。但对于特定突变位点之外的NSCLC患者[1]，仍迫切需要新的治疗靶点。本研究建立了一种基于预后价值的筛选生物标志物的方法，同时考虑候选基因在NSCLC良恶性组织中的表达差异，最终选取母体胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)作为研究对象。MELK又名小鼠蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶38(MPK38)[2]，是一种AMPK相关的丝氨酸—苏氨酸激酶，在不同物种间高度保守[3]。在正常组织中，MELK仅在睾丸中表达，其在胸腺和小肠中的表达水平非常低[4]。MELK最初被鉴定为信号转导因子，作为细胞内信号调节物发挥重要作用，并影响各种细胞和生物学过程，包括细胞周期、细胞增殖、凋亡、剪接体组装、基因表达、胚胎发育、造血和肿瘤发生等[3]。MELK可被不同外源性刺激激活，包括H2O2、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、硫精氨酸、离子霉素、TGF-β1、5-氟尿嘧啶(5FU)和阿霉素(DOX)等，它们可触发ASK1，TGF-β和p53信号通路[5]。此外，研究证实MELK具有广泛的底物特异性。可通过磷酸化激活MAP3K5/ASK1，以激活细胞凋亡，也可通过介导CDC25B的磷酸化调节细胞周期[6]，从而导致细胞增殖和致癌。虽然MELK在其他肿瘤中已有相关研究[7-8]，但在NSCLC预后判断中的作用尚未明晰。本研究基于TCGA和GEO数据库等公开的基因表达谱数据，旨在阐明MELK在NSCLC中的预后价值。

1 材料和方法

1.1数据检索方法 以“肺癌”为关键词检索肿瘤基因组图谱计划(TCGA)和基因表达谱(GEO数据库)，并制定检索策略，检索流程见图1。研究类型设置为“expression profiling by array”，条目类型设置为“datasets”。所有入选数据集的样本量≥50。数据集必须包括必要信息，如生存信息、人口学特征、肿瘤分期和治疗信息等。数据库检索由两名研究人员独立进行，并对有异议的数据集进行讨论并最终达成共识。

1.2数据采集与处理 由两名研究人员独立提取所有纳入数据集中的信息。对于入选的芯片及测序数据，采用基于R软件(3.5.0版本)的循环算法计算每个数据集中基因的HR值，筛选具有统计学显著性的基因及其HR值，各个结果数据依据基因名进行匹配。根据HR值计算得出2个指标：HRh和HRl，其中HRh定义为数据集中所有大于1.0的HR值总数;HRl定义为数据集中所有小于1.0的HR值总数。分析流程见图2。

图1 文献检索流程

图2 基因筛选分析流程

1.3统计学分析 使用R3.5.0(R Foundation for Statistical Computing，Vienna，Austria)和GraphPad Prism 5.0软件包(GraphPad Software，Inc.，San Diego，USA)进行统计分析。两组或两组以上均值的比较采用t检验和单因素方差分析。生存曲线采用Kaplan-Meier法并进行Log-Rank检验。用单因素和多因素Cox模型计算MELK的HR值及其95%CI以评价其对预后的影响。通过CochranQ和I2检验评价基于MELKmRNA水平的各个数据集结果的异质性。当I2>50%或P<0.1时采用随机效应模型(Dersimonian-Laird法)，其他采用固定效应模型(Mante-Haenszel法)。

2 结果

2.1研究特征 通过关键词检索从GEO数据库中初筛选出779个潜在相关数据集。通过样本大小和组织类型筛选后，共获取680个数据集。根据数据摘要和临床参数，最终从GEO数据库中获得7个相关研究(GSE14814[9]、GSE30219[10]、 GSE37745[11]、GSE42127[12]、GSE50081[13]、 GSE68465[14]、 GSE68571[15])，包括TCGA数据库中独立的肺腺癌、肺鳞癌数据，最后纳入8个腺癌和6个鳞癌数据集，包括1 536例肺腺癌和739例肺鳞癌患者。所有纳入数据集的基线特征见表1。

表1 纳入数据集的基线特征

注：LUAD，肺腺癌; LUSC，肺鳞癌; NR，未报道; OS，总生存期。

2.2预后相关基因筛选 基于循环算法，计算选定数据集中所有基因的HR值，并计算HRh和HRl指标。在LUAD数据集中，排列前5位且提示预后良好的基因为CAT、FRZB、CTSH、PBXIP1、NPC2，提示预后不良的基因为TK1、INPP4B、TTK、MELK、NPAS2。在LUSC数据集中，排列前5位且提示预后良好的基因分别为ARMCX6、C3orf58、CYB5R2、DGKA、DUSP9，提示预后不良的前5位基因是ABCC3、ALDH7A1、ERBB2、FTO、HTR1D。见表2、3。此外，考虑基因在不同组织中的表达水平，TK1、TTK和MELKmRNA在肿瘤组织中的表达水平明显高于正常组织，而INPP4B、NPAS2在肿瘤组织中的表达水平与正常组织相比，差异无统计学意义。

表2 LUAD患者预后相关基因的筛选

表3 LUSC患者预后相关基因的筛选

2.3MELKmRNA在肿瘤、正常组织及不同病理分期中的表达 在TCGA LUAD数据中，MELKmRNA在肿瘤组织中的表达水平显著高于正常组织(t=24.906，P<0.001，图3A)，且从Ⅰ～Ⅳ期逐渐升高(F=3.779，P=0.011，图3B)。与LUAD结果相似，在LUSC数据中MELKmRNA在肿瘤组织中的表达水平亦明显高于正常组织(t=26.401，P<0.001，图3C)，且从Ⅰ～Ⅳ期逐渐升高(F=4.195，P=0.002，图3D)。

注：A，正常对照及肺腺癌组织中MELKmRNA表达; B，肺腺癌不同分期MELKmRNA表达; C，正常对照及肺鳞癌组织中MELKmRNA表达; D，肺鳞癌不同分期MELKmRNA表达

图3 不同肿瘤组织及不同病理分期的MELKmRNA表达水平

2.4MELKmRNA表达水平与NSCLC患者预后的关系 对NSCLC各数据集分别进行单因素和多因素Cox模型分析。LUAD和LUSC患者各数据集中MELKmRNA的P值、HR值和95%CI值见表4和表5，LUAD和LUSC患者各数据集的生存曲线见图4和图5。

表4 肺腺癌数据集Cox模型分析结果

表5 肺鳞癌数据集Cox模型分析结果

注：A，GSE30219；B，GSE37745；C，GSE42127；D，GSE50081；E，GSE68465；F，GSE14814；G，GSE68571；H，TCGA。

注：A，GSE30219；B，GSE37745；C，GSE42127；D，GSE50081；E，GSE14814；F，TCGA。

2.5对LUAD和LUSC患者进行MELK影响预后的联合分析 对LUAD的Cox多因素生存分析结果效应量进行meta合并，异质性检验显示其无明显的统计学异质性(I2=0.0%,P=0.562)，故而采用固定效应模型合并HR值。结果显示，MELKmRNA高表达与较低的总生存率(OS)显著相关(合并HR=2.162，95%CI:1.796～2.604)，结果见图6A。对LUSC的Cox多因素生存分析结果效应量进行meta合并，异质性检验显示存在统计学异质性(I2=67.1%,P=0.009)，故采用随机效应模型合并HR值。结果显示LUSC患者MELKmRNA和OS之间无显著关联(合并HR=1.304;95%CI:0.953～1.786)，结果见图6B。

图6 肺腺癌和肺鳞癌患者多因素生存分析的森林图

3 讨论

近年来NSCLC发病率和死亡率在各类肿瘤中均居于前列，严重威胁着人类健康。因此，寻找新的生物标志物对NSCLC的诊断和治疗具有重要意义。目前同类研究较少，Piao等[16]基于GEO数据利用GEO2R功能寻找差异表达基因，并通过STRING、Cytoscape和MCODE构建蛋白质相互作用网络(PPI)，以筛选关键基因。该方法主要基于基因表达差异，而本研究所采用的方法主要基于预后价值。与上述网站检索方法相比，本研究方法存在以下几点差异：首先，本研究基于每个独立的数据集进行分析，是基于较少的样本量得出的结果，合并后更加稳健。通常在科研设计中，组间期望差异越小，所需总样本量越大，反之，样本量越大，越易得到显著的结果，同时也意味着较高的假阳性率。其次，HRh和HRl可用来判断其相应基因的预后价值。结合HRh和HRl具体数值有助于明确基因的预后价值，即HRh值越高，同时HRl值越低，表明该基因为NSCLC患者的高风险基因;呈相反趋势则表明该基因对NSCLC患者的保护作用越强，因此保证了筛选结果的准确性。Li等[17]采用WGCNA分析法鉴定肺腺癌中与生存相关的表达模块，其从识别的模块中，获取了3个关键基因UBE2C，TPX2和MELK，这一过程主要是通过生物信息方法并基于单个数据集来实现的。

在本研究中，LUAD和LUSC患者肿瘤组织中MELKmRNA表达水平明显高于正常组织，且从Ⅰ～Ⅳ期逐渐升高。有研究显示，MELK在多种癌症中表达升高，包括乳腺癌、肝癌、胃癌、急性髓系白血病、胶质母细胞瘤、肾癌等[7,18-20]。此外，MELKmRNA的高表达与LUAD患者预后不良相关，这与Speers等[21]和Kuner等[8]在乳腺癌和前列腺癌患者中的研究结果相似。本研究中，LUSC数据集的总HR值显示无统计学意义，但它仍然揭示了一种趋势，即MELK高表达与LUSC患者的不良预后可能相关。这种预后差异可能归因于肺腺癌及鳞癌不同的组织学特征、不同的治疗手段以及对治疗手段的反应率的差异造成的。本研究是基于公共数据的挖掘研究，由于不同数据产生于不同的检测平台，包括基因芯片和测序数据，数据存在一定的异质性，本研究的结果还有待更高级别证据的研究进一步证实。综上所述，MELKmRNA在肺腺癌中的表达水平越高其预后越差，MELK有望成为肺腺癌患者治疗的潜在的分子靶点。