RNA靶向系统Crispr/Cas13在分子诊断及临床治疗中的研究进展*

王泽华，应苗法，赵蕊，李明星(.浙江大学医学院附属邵逸夫医院药剂科，杭州 3006; 2.杭州市下沙医院药剂科，杭州 3008)

近年来，Crispr/Cas系统发展迅速，在研究细胞功能和临床治疗方面具有广阔的应用前景，其中靶向切割DNA特定位点的Cas9和Crispr效应蛋白Cpf1已被应用于各种基因组的编辑，但调控RNA的分子工具非常有限[1-2]。在生物界，RNA几乎参与了所有的生物活动，除了参与蛋白质的表达，还参与了基因表达[3]。目前，一种新型的RNA靶向的Ⅱ类Ⅵ型Crispr系统效应蛋白Cas13被开发出来，其能够特异性靶向并剪切RNA，随后对附近的RNA片段进行无差别的“附带剪切”，具有致休眠或程序性的凋亡效应。利用该脱靶效应，许多学者开发了一系列用于疾病诊断的工具，并应用于抗病毒及抗肿瘤等疾病治疗[4-7]。通过Cas13亚型筛选及功能性蛋白残基的改造，结合其他RNA操纵酶，进一步提高Cas13酶活性和特异性，改变Cas13酶功能，能够实现RNA敲除、编辑、示踪等转录组水平的调控[8]。Cas13具有靶向性、特异性、安全性较高的优势，但是目前Cas13在真核生物上的研究仍不足，深入研究Cas13多功能RNA调控系统对于揭示疾病的发生机制具有重要意义。本文主要总结RNA靶向的Crispr/Cas13系统的特点和作用机制，并对其在分子诊断和疾病治疗中的研究进展作一综述。

1 Crispr/Cas13系统的特点及作用机制

Cas13是一种RNA靶向剪切的新型CRISPR酶，与靶向DNA的核酸酶Cas9不同。Cas13具有加工crRNA和crRNA介导的RNA靶向剪切的双重核酸酶活性，能够特异性识别靶向RNA片段，激活后特异性剪切靶向片段，Cas13还具备非特异性RNA核糖核苷酸酶(RNA ribonuclease, RNase)活性，随后对附近的RNA片段进行无差别的“附带剪切”，参与调控基因的表达及细胞功能学的稳态。

1.1Crispr/Cas13系统的特点 古生菌和约50%的细菌都具备Crispr/Cas适应性免疫系统，它能够帮助微生物抵抗病毒或外来核酸[9-10]。靶向DNA的Crispr/Cas系统，例如Crispr/Cas9和Crispr/Cas12a是人类操纵和研究DNA、研究基因功能以及揭露生物学机制的重要工具，在基础研究和临床转化研究上得到了广泛应用[11-13]。与Cas9类似，Cas13属于Ⅱ类Ⅵ型Crispr系统效应蛋白，含有2个高等真核生物和原核生物核苷酸结合(higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding, HEPN)结合域。Abudayyeh等[14]对Crispr/Cas13系统进行深入研究，首次证实了Cas13是一种RNA靶向剪切的新型Crispr酶。

Cas13家族包含4种亚型，即Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d[15-16]。Cas13a是一种双组件系统，其结合域的催化位点在蛋白质外表面，只需1条crRNA介导，对RNA进行顺式或反式切割。Cas13b系统缺少Cas1和Cas2，具有RNase，靶向RNA的二级结构，Crispr/Cas系统中未描述的相关蛋白Csx28能增强Cas13b介导的RNA干扰，Csx27对其有抑制作用[17]。Cas13d类蛋白平均长度要比Cas13a和Cas13c短190～300个氨基酸序列，由于其长度短，通过调控Cas13d效应器，可用于RNA的调控和检测[18]。对于Cas13c系统，目前缺乏相关的研究。

1.2Crispr/Cas13系统的作用机制 Cas13具有双重酶活性，能够将前体crRNA加工成为成熟的crRNA，并凭借crRNA介导实现靶向RNA剪切[4]。Cas13利用向导RNA实现RNA准确靶向，向导RNA包括短发卡结构和间隔序列，其中Cas13通过识别向导RNA的短发卡结构并与其形成复合物，并通过间隔序列片段识别能够互补的靶向区域，并进行靶向识别剪切，它的剪切具备前间隔序列侧翼位点(protospacer-flanking site, PFS)结构依赖性，即在原间隔序列前的碱基应当为A、C或U[14,19]。特殊的是，有学者发现，在原核细胞内，Cas13识别RNA并进行特异性剪切之后，并未失活，其还具有“附带剪切”的RNase活性，能够剪切邻近的单链RNA，引起细胞休眠或细胞程序性死亡[4,14](图1)。但是Cas13这种非特异性RNase活性却为其在核酸检测及疾病治疗方面的应用提供了启示。

注：Phage RNA,噬菌体RNA；Mature crRNA,成熟的RNA；host mRNA,宿主mRNA；Collateral cleavage,附带剪切。

图1 RNA靶向的原核生物免疫系统Crispr/Cas13的靶向机制

2 Crispr/Cas13系统在分子诊断中的作用

目前，许多基于多聚酶的方法被应用于RNA扩增和后续的检测，但其中的大多数方法都需要对RNA靶向片段进行合理设计，且RNA靶向片段具有严格的设计限制[20-21]。Cas13能通过crRNA介导特异性识别靶向RNA片段，激活后特异性剪切靶向片段，随后进行无差别的“附带剪切”，虽然该活动对细胞生存不利，但利用RNA引起的爆发性的底物非特异性剪切应用于特定RNA检测[14]。Crispr/Cas13应用于核酸检测具备特异性高的特点，RNA靶向的Crispr/Cas13系统特异性达到单碱基错配，并且其剪切具备PFS依赖性；另外，Cas13还具有较高的RNase活性，利用该系统进行检测灵敏度较高。

Cas13具备非特异性剪切的“附带剪切”活性，利用该系统能特异性识别剪切靶向RNA片段并引发后续的非特异性剪切，通过引入猝灭荧光RNA报告基因能够实现特定核酸片段的检测[4]。当crRNA介导Cas13特异性识别靶向RNA片段，RNA报告基因通过RNA连接荧光基团和猝灭基团，激活Cas13酶活性，除了进行目标RNA的特异性剪切，还将进行无差别的“附带剪切”，切断连接荧光基团和猝灭基团的RNA链，猝灭效应消失，可以通过检测荧光信号进行特定核酸检测。研究发现，靶向的RNA浓度在1～10 pmol/L时，仅0.02%的Cas13a系统被激活，而剪切效率却达到25%～50%，每个靶向剪切将会导致后续数十万个非特异性靶向剪切，信号进行放大，随后能在30 min内检测到特异性增强的荧光信号；但是，pmol/L级别的检测浓度远远未达到临床需求，故而更多策略被设计用来提高RNA的检测限[4]。

由于上述检测方式未达到临床检测灵敏度，一种高灵敏度报告基因开锁法(high-sensitivity enzymatic reporter UnLOCKing, SHERLOCK)在2017年由美国学者Gootenberg等[22]提出，该技术是通过重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)，对样本中DNA或RNA进行扩增，使得检测阈值达到单拷贝级别，这种扩增是等温扩增，可以在常温下进行，扩增后的DNA在进行T7核糖核酸聚合酶介导的转录后，引入Cas13a工具进行检测，一旦含有标靶RNA序列，便会大量剪切REPORT分子，检测到荧光信号，具有较高的灵敏度。引入了RPA之后，SHELOCK技术能够检测到amol/L级浓度的RNA或DNA，显著提高了Crispr/Cas13系统的临床应用价值。SHERLOCK技术能够检测在血液中或尿液中的寨卡病毒和登革热病毒，识别特定的细菌类型，检测耐药基因，识别游离的DNA中的癌症突变，快速阅读人类遗传信息的改变。

然而，这项技术也存在短板，如在1个反应中只能检测1个靶点，并且对检测设备要求较高，对此学者们又研发了第二代的SHELOCK技术。相较于第一代SHERLOCK，第二代SHERLOCK具备成本低，效率高，检测速度快，操作方便等优点，主要表现在以下4个方面：(1)在通道检测上，通过不同Cas亚型对于核苷酸序列的剪切取向，能够通过使用不同亚型Cas系统，在单反应中实现4个通道的检测；(2)能够进行定量测定，且灵敏度达到2 amol/L；(3)在灵敏度上，第二代的SHELOCK又进行了改进，通过结合Cas13和Crispr 系统内切核糖核酸酶6(Crispr system endoribonuclease enzyme 6, Csm6)实现信号进一步放大，灵敏度达到第一代SHELOCK的3.5倍，Csm6能够被Cas13附带剪切后的产物激活，进一步剪切富含A-C碱基序列的报告基因，通过连接不同的荧光分子，可以实现多通道或单通道信号放大检测；(4)通过开发SHELOCK试纸，受试者仅通过试纸上阳性条带的观察，便能确定检测结果[5]。

3 Crispr/Cas13系统在疾病治疗中的应用

Cas13具备非特异性剪切的“附带剪切”活性，主要应用于病毒快速检测、菌型鉴定、耐药基因和癌症疾病突变检测等方面，除此之外，利用该特性在抗病毒和抗肿瘤等疾病治疗中的应用也得以拓展。Cas13具备的RNA特异性识别与剪切的特性也使其成为RNA编辑的有效工具，具备特异性高的特点。Crispr/Cas13的核酸编辑功能或许能为许多基因类疾病治疗提供另一种途径，尤其是RNA水平变化导致的疾病。

3.1抗病毒作用 Crispr/Cas13能够保护古生细菌或者原核生物免受RNA噬菌体或外来核苷酸侵袭，它通过特异性剪切和crRNA互补的RNA片段达到抗单链RNA病毒的目的，这种活性被利用来进行抗病毒治疗。Bawage等[23]研究发现，通过Crispr/Cas13a系统设计和筛选几种crRNA，并通过靶向类呼吸道合胞体病毒(human respiratory syncytial virus, hRSV)和甲型流感病毒(influenza A virus, IAV)，从而裂解病毒RNA和核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)，达到抗病毒的作用；但病毒RNP的二级结构和蛋白质含量以及RNP基因组的构成对crRNA和Cas13a的靶向性具有影响。Freije等[6]研发了一种名为Cas13辅助限制病毒表达和读出(Cas13-assisted restriction of viral expression and readout, CARVER)的工具，结合Cas13的病毒杀伤和其诊断衍生化工具SHERLOCK，通过计算机从数百个可能感染人类的病毒中筛选出几千个有潜能的Cas13 crRNA 靶向片段，进行靶向抗病毒治疗，并通过SHERLOCK检测Cas13抗病毒治疗后的病毒RNA水平和crRNA突变情况，提示Cas13在抗病毒方面的疗效较好。另有研究发现，Cas13能有效抵抗淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV)、IAV和水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis, VSV)[6]。CARVER平台能有效抗病毒治疗，并且能够快速实时检测病毒RNA水平，反馈治疗结果，提示Crispr/Cas13在实现诊疗一体化的抗病毒治疗中具有较好的应用价值。

3.2抗肿瘤作用 Crispr/Cas13系统在真核细胞中的应用仍然处于探索期。Wang等[7]研究发现，在表皮生长因子受体变异体Ⅲ (epidermal growth factor receptor variant Ⅲ, EGFRv Ⅲ)过表达的人脑胶质瘤细胞(human glioblastoma, GBM)中，Cas13a识别靶向基因后，触发“附带剪切”，引发肿瘤细胞死亡；其进一步通过体外实验结果显示，Crispr/Cas13a系统能够有效抑制EGFRv Ⅲ人神经胶质瘤U87细胞在小鼠颅内的原位进展，具有强大的肿瘤抑制作用，提示Crispr/Cas13a在治疗胶质瘤方面展现出较好的应用前景。

3.3对遗传性疾病的治疗作用 RNA在生命过程中起非常重要的作用，但是能够进行RNA干扰的分子工具非常有限。有研究报道，直系同源的Cas13系统在原核生物内发生混乱剪切，但在哺乳类细胞宿主转录组很少出现脱靶效应，提示Crispr/Cas13系统可能成为调控真核生物基因转录后水平的重要手段[8,23-24]。Abudayyeh等[8]提出，通过改造Cas13a，能够干预哺乳动物细胞RNA。另有研究发现，Cas13a直系同源中Lwa-Cas13a能够在哺乳细胞中表达，并且能有效敲除报告基因或者内源性转录本，提高了特异性，降低了脱靶性，该研究利用Lwa-Cas13a成功降低了人胚肾细胞和黑色素细胞中鼠类肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)、趋化因子受体4(CXC chemokine receptors 4,CXCR4)和肽基脯氨酰异构酶B(peptidylprolyl isomerase B,PPIB)3个内源性基因的表达[25-26]。双同源框4(double homeobox 4, DUX4)异常表达导致面肩肱型肌营养不良症(facioscapulohumeral muscular dystrophy, FSHD)的发生，常伴有肌肉萎缩和无力症状。Rashnonejad等[27]设计了靶向DUX4mRNA不同区域的片段Cas13b-gRNA 片段，成功抑制了DUX4蛋白表达，并且成功抑制体内外细胞死亡，提示Cas13作为RNA干预工具的临床应用前景。

RNA编辑作为一种更为安全的编辑技术，可逆性地逆转RNA信息，避免造成永久性突变，成为研究和临床疾病治疗的重要工具[28]。为了扩展Cas13系统在RNA研究上的应用，有学者通过改变Cas13酶HEPN区域的功能性氨基酸残基，制备了失去了催化活性的变异体(catalytically inactive Cas13, dCas13)，保留了其特异性识别和结合靶向片段的特性，却失去了内切酶活性，这些发现使得研究者能够利用dCas13进行特异性转录片段的结合并进行后续RNA编辑[29]。目前发现,哺乳动物中含有3种腺苷脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA,ADAR)，即ADAR1、ADAR2和ADAR3；RNA特异性ADAR能够通过水解脱氨作用催化腺苷到肌苷的内源性编辑[30]。Cox等[29]制备了一种RNA单碱基编辑工具，通过融合dCas13和ADAR2腺嘌呤脱氨酶活性域，实现腺苷到肌苷的RNA编辑目的，逆转哺乳动物中RNA水平突变导致的疾病。在此基础上，Abudayyeh等[31]报道了一种由催化胞苷到尿苷的RNA编辑工具，可利用内源性ADAR进行RNA的编辑，将ADAR2转化成胞苷脱氨酶，同时保留腺苷脱氨酶活性，提高RNA突变编辑数目，并且能够实现磷酸信号相关残基的调控，该研究表明该系统能够激活β-连环蛋白，促进细胞生长。许多RNA靶向编辑依赖于递送外源性或化学修饰的向导RNAs，但需要克服递送屏障及体内免疫原性等问题。Qu等[32]引入一种利用内源性ADAR进行RNA程序性编辑的新型RNA单碱基编辑技术，应用一段改造过的ADAR招募RNA(ADAR-recruiting RNAs, arRNAs)，招募机体自身ADAR1或ADAR2酶，实现胞苷到尿苷的编辑，编辑效率高达80%，并且具备高度特异性；该系统能够恢复Hurler综合征患者来源的原代成纤维细胞中α-L-艾杜糖醛酸酶的催化活性，且避免免疫反应。

4 小结与展望

本文对Crispr/Cas13系统的特点及作用机制进行了详细的叙述，总结了Crispr/Cas13系统在分子诊断及疾病治疗中的作用。Crispr/Cas13系统原本是古生细菌和原核生物保护自身的防御系统，具有加工pre-crRNA成熟和crRNA介导的RNA靶向剪切的双重核酸酶活性，但是在原核生物内的混乱的“附带剪切”效应使其应用受限，在使用时存在脱靶的可能性，存在一定的细胞毒性。但正是利用脱靶效应，这种不被期待的“副作用”，开发了一系列用于诊病诊断的工具，并且这种“附带剪切”致休眠或程序性的凋亡的特性也被应用于抗病毒及抗肿瘤等疾病治疗，进一步的探索证明凭借Cas13的“附带剪切”效应，结合多种工具，能够实现诊疗一体化平台的搭建。当前通过Cas13不同亚型筛选及Cas功能性蛋白残基的改造，或结合其他RNA操纵酶，可以进一步提高Cas13酶活性和特异性，改变Cas13酶功能，实现RNA敲除、编辑、示踪等目的。Cas13多功能RNA调控平台的发展对于深入研究RNA的功能，对于促进生命科学和医学领域的发展具有重要意义。