多种分子遗传技术应用于2例小额外标记染色体胎儿的产前筛查与诊断*

季修庆，林颖，王玉国，周冉，李璃，刘安，周静，王亚，胡平，许争峰(南京市妇幼保健院遗传医学中心，南京 210004)

小额外标记染色体(small supernumerary markerchromosome, sSMC)是指在染色体核型分析中，除正常染色体外，出现的不明结构、无法辨别其来源和特征的染色体，导致染色体数量和基因拷贝数发生变化，其可来源于任何一条染色体，携带者临床症状从无到严重畸形[1-2]。对携带sSMC的胎儿进行产前筛查和诊断明确其来源和结构组成，对临床遗传咨询非常重要。

基于高通量测序的无创产前基因检测(non-invasive prenatal tests, NIPT)已广泛应用于胎儿染色体数目异常检测，近年来亦多应用于染色体微缺失或微重复的产前筛查[3-4]。除了传统的染色体G显带技术，多种分子遗传技术在sSMC胎儿产前诊断中广泛应用，如染色体微阵列技术(chromosomal microarray analysis, CMA)是最近发展起来的主要用于检测染色体亚显微缺失/微重复的一项技术，目前已应用于sSMC的产前诊断[1-2]；多重连接依赖探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)是一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的分子技术，业内已广泛用于产前快速诊断胎儿染色体非整倍体异常[5]，也常应用于Y染色体微缺失检测[6]。本研究主要探讨以上技术在携带sSMC胎儿的产前筛查和诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1研究对象 孕妇1，35岁，孕3产1，2017年6至7月于南京市妇幼保健院遗传医学中心就诊，孕16+5周行NIPT检测，检测结果为18三体高风险，经过遗传咨询和知情同意选择后，行羊膜腔穿刺术；本次妊娠未接触有害物质。孕妇2，37岁，孕3产1，2018年3至4月于南京市妇幼保健院遗传医学中心就诊，孕15+4周进行NIPT，检测结果为性染色体异常(47,XXY)高风险，经过遗传咨询和知情同意选择后，进行了羊膜腔穿刺术，本次妊娠未接触有害物质。本研究经南京市妇幼保健院医学伦理委员会批准(No.NFKSL-111-2019)，患者及家属知情同意。

1.2主要仪器和试剂 羊水细胞培养基(杭州博圣生物公司)；人外周血细胞培养基(青岛莱佛生物工程研究所)；基因组DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)；MLPA P095染色体非整倍体检测试剂盒、MLPAP360-B1Y染色体微缺失检测试剂盒(荷兰MRC-Holland公司)。GSL-120全自动染色体扫描系统(德国莱卡公司)；3130型基因分析仪(美国ABI公司)；NanoDrop 2000紫外分光光度计(美国莫赛飞公司)；GSL-120全自动染色体扫描系统(德国莱卡公司)；HumanCytoSNP-12 BeadChip Kits芯片(美国Illuminate公司)。

1.3方法

1.3.1胎儿羊水细胞及胎儿双亲外周血染色体G显带核型分析 分别采集2例孕妇羊水20 mL，按照羊水细胞核型制作实验操作规范常规收获细胞，染色体制片；分别取2例胎儿的双亲空腹静脉血3 mL，经过常规血细胞培养收获和染色体制片；采用GSL-120全自动染色体扫描系统对染色体玻片扫描，并用软件对胎儿及父母的染色体核型分析，结果分析按照人类细胞遗传学国际命名体制(2016)进行。

1.3.2基因组DNA提取 取10 mL羊水，1 800 r/min离心10 min，取沉淀，按照基因组DNA提取试剂盒说明书提取羊水细胞基因组DNA， TE溶液洗脱DNA，NanoDrop 2000紫外分光光度计测定DNA浓度，取吸光度(A260/280 nm)为1.7～1.9的样本用于后续实验，样本置-80 ℃保存。

1.3.3MLPA技术检测染色体数目异常 用MLPA P095非整倍体检测试剂盒检测，该试剂盒内共有36对探针，其中21、13、18、X号染色体上分别有8对探针，Y染色体上有4对探针(其中3对位于短臂，1对位于长臂)，通过探针检测这些染色体的非整倍体异常和探针范围内的染色体结构异常。扩增产物经3130型基因分析仪进行毛细管电泳，结果经GeneMapper软件分析得出峰高、峰面积和片段长度等数据，计算样本的标准化值(每条探针的峰面积/同组峰面积的平均值)，并与软件自带的正常二倍体样本相应产物峰的标准化面积平均值进行比较，得出的比值即该样本DNA 拷贝数，比值=1.0为正常，比值=1.5为染色体三倍体，比值=0.5为染色体单体。

1.3.4CMA检测 选用HumanCytoSNP-12 BeadChip Kits芯片，该芯片有约30万个检测位点，按照该芯片说明书对羊水基因组DNA进行芯片杂交试验，采用iscan扫描系统进行数据采集，根据探针杂交给出的荧光信号值强弱以及等位基因型的定性结果判断微缺失、微重复，结果采用Karyostudio 1.3.11 Build36.1软件进行数据分析。检测出的拷贝数变异(copy nu×106bper variations, CNVs)根据多态性数据库(http://projects.tcag.ca /variation /) 、DECIPHER病理性数据库(http://decipher.sanger.ac.uk/) 和OMIM数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov /omim) 进行比对分析。根据检出CNVs 的性质，按照美国医学遗传学会的指南[7]，将CNVs分为4个等级:临床致病性CNVs，临床可能致病性CNVs，临床意义不确定性CNVs，良性CNVs。

1.3.5MLPA技术检测Y染色体微缺失 使用P360-B1Y染色体微缺失试剂盒[包含55对探针，其中SRY基因探针1对，针对Y染色体无精子因子(AZF)区域的探针：AZFa区域14对探针、AZFb区域16对探针、AZFc区域的12对探针，参考探针12对]，按照试剂盒说明书操作，结果分析同1.3.3。

2 结果

2.1胎儿1各项检测结果 胎儿1的染色体非整倍体检测结果为18号染色体短臂部分三体，位于18p11.21的MC2R-2探针和位于18p11.32的TYMS-7探针检测出重复，比值在1.5～2之间(图1A)；胎儿1的G显带核型为47,XY,+Mar(图1B)；胎儿1的CMA检测结果发现1个致病性CNVs：18号染色体p11.32p11.21区段存在14.96×106bp的拷贝数重复(4份拷贝)：arr[hg19]18p11.32p11.21(136,227-15,099)×4(图1C)。

注：A, MLPA检测染色体非整倍体异常结果：18p11.32-p11.21区间的2个探针出现三倍体拷贝峰，比值在1.5～2之间(如箭头所示)；B,羊水细胞G显带结果：47,XY,+Mar(如箭头所示)；C,CMA检测的结果：18p11.32-p11.21区域出现四倍体重复(箭头所示)。

图1 胎儿1的MLPA、G显带核型和CMA检测结果

2.2胎儿2各项检测结果 胎儿2的MLPA快速诊断结果为：性染色体的探针信号显示存在2条正常X染色体及1个短臂缺失的Y染色体(图2A)；胎儿2的G显带核型为47,XX,+Mar(图2B)；MLPA技术检测Y染色体微缺失结果为SRY基因和生精区AZFc区缺失(图2C)。

注：A, MLPA检测染色体非整倍体异常结果：以正常男性的结果为对照，显示存在2条正常X染色体，但Yp11.31上3个探针均未显示缺失，位于Yq11.21的1个探针有扩增，提示Y染色体短臂缺失(箭头所示)；B,羊水细胞G显带结果为47,XX,+Mar(箭头所示)；C, MLPA技术检测Y染色体微缺失结果：SRY基因探针未扩增，位于Yq11.223上的12个探针也没有扩增信号，即生精区AZFc区缺失(箭头所示)。

图2 胎儿2的MLPA、G显带核型和MLPA检测Y微缺失结果

2.3胎儿双亲的外周血染色体核型结果 2例胎儿母亲的外周血染色体核型均为46,XX，父亲的外周血染色体核型均为46,XY，故2例胎儿标记染色体均为新发突变。

3 讨论

本研究中胎儿1和胎儿2的NIPT检测结果分别为18三体和性染色体异常高风险，故而进行侵入性羊水产前诊断。因MLPA快速产前诊断试剂盒中有18号和性染色体的探针，孕妇均选择MLPA快速诊断及羊水染色体G显带核型检测。MLPA结果显示：胎儿1短臂部分18三体，胎儿2存在2条X染色体和1条短臂缺失的Y染色体；核型结果均为sSMC携带者。由于MLPA技术存在探针覆盖范围有限等局限性，而CMA技术探针范围覆盖广、能精确检测变异的范围，所以本研究选择CMA技术验证胎儿1 MLPA检测结果；胎儿2的快速诊断结果显示有短臂缺失的Y染色体，因CMA技术在Y染色体上设计的探针较少，故而选择MLPA技术检测Y微缺失。胎儿1的CMA验证结果显示18号染色体p11.32p11.21区段存在14.96×106bp的拷贝数重复(4份拷贝)，为致病性CNVs[8]；胎儿2验证结果显示SRY基因区和生精区AZFc区缺失，结合核型结果，属于性染色体异常综合征；2例胎儿父母均选择终止妊娠。

近年来随着NIPT的测序数据量增加，信息处理算法不断升级，逐步扩展至对染色体CNVs的检测[3]，其中测序深度是检测微小变异的主要决定因素[9-10]。传统的G显带核型分析可以显示sSMC数目和形态，但分辨率较低、周期长，且不能确定其来源；MLPA技术周期短、成本低，缺点是通量小，探针不能覆盖整个基因组；CMA技术具有高通量、高分辨率、快速等优点，但目前成本相对较高。本研究中胎儿1的MLPA结果显示，18号染色体的2个探针扩增信号比值在1.5～2之间(图1A)，判读为三倍体，而CMA结果显示该区域的四倍体(图1C)，分析原因主要是由于MLPA技术存在局限性：其通过对照扩增产物的相对峰信号反映探针靶序列的相对拷贝数，属于定性和半定量的分子技术，而CMA技术直接根据探针杂交给出的荧光信号值强弱以及等位基因型的定性结果判断微缺失、微重复，能更准确地检测CNVs。

综上所述，随着NITP测序深度的增加，可以有效地筛查出sSMC胎儿，每一种分子遗传诊断技术应用于sSMC胎儿产前诊断都有其优缺点，应与传统的G显带核型分析相结合，各技术结果相互验证、互为补充，为临床遗传咨询提供更全面和详细的信息。