磁微粒化学发光法检测乙型肝炎6项血清标志物关键性能指标验证

周碧燕， 赵丽萍， 陶文富， 方灵燕， 李少芳， 张可可， 何亚妮， 韦荣国

（南宁市第一人民医院医学检验科，广西 南宁 530022）

由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染所致的乙型肝炎是最常见的病毒性肝炎。据统计，全球约有1/3的人曾感染HBV，2015年慢性HBV感染者约为2.57亿人，占全球人口的3.5%，每年约有88.7万人死于慢性HBV感染引起的肝硬化和肝细胞癌等相关疾病[1-2]。我国是目前世界上HBV感染人数最多的国家，1992年全国HBsAg携带者占总人口的9.75%，2006年下降到7.18%[3]，在1～29岁人群中，HBsAg的患病率从1992年的10.1%下降到2014年的2.6%。尽管如此，我国仍有7 700～9 700万人患有慢性HBV感染，其中2 000～3 000万人患有活动性肝病[4]。快速、及时、准确地检测乙型肝炎6项血清标志物[乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎表面抗体（hepatitis B surface antibody，HBsAb）、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙型肝炎e抗体（hepatitis B e antibody，HBeAb）、乙型肝炎核心抗体（hepatitis B core antibody，HBcAb）、乙型肝炎前S1抗原（pre S1 antigen，PreS1Ag）]对乙型肝炎的防治具有重要意义。为此，本研究参照中国合格评定国家认可委员会（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）的相关标准，对磁微粒化学发光法检测血清HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb和PreS1Ag的关键性能指标进行验证，并统计该检测系统使用前后的样本周转时间（turn-around time，TAT）。

1 材料和方法

1.1 样本收集

收集2019年2—3月南宁市第一人民医院医学检验科完成检测后剩余的临床血清样本，其中确诊为乙型肝炎患者的血清样本18份（患者男10例，女8例，年龄17～80岁）、体检健康者血清样本20份（男8名、女12名，年龄3～84岁）。

1.2 仪器与试剂

将Autolas B-1 Series免疫流水线分析系统（郑州安图生物工程股份有限公司，含4台AutoLumo A2000Plus全自动化学发光测定仪、轨道系统、前处理系统和后处理系统）与配套试剂（磁微粒化学发光法）、校准品、质控品组成检测系统（简称免疫流水线），严格按本实验室标准操作规程进行操作。

1.3 检测系统的性能验证

1.3.1 精密度、线性范围、可报告范围、参考区间和检出限的验证 参照WS/T 420—2013[5]、WS/T 492—2016[6]、WS/T 494—2017[7]、CNASGL037：2019[8]和CNAS-GL038：2019[9]规定的方法对精密度、线性范围、可报告范围、参考区间和检出限进行验证。采用磁微粒化学发光法检测20名体检健康者的血清样本，将结果与厂商提供的参考区间进行比较。如落在参考区间外的检测结果不超过2个，则参考区间可直接使用，否则需重新建立参考区间。

1.3.2 样本TAT 样本TAT的计算参照MILER等[10]的方法。由于在使用免疫流水线前，当天检测的样本送达时间截止至上午10：30，10：30后送达的样本放第2天检测，而使用免疫流水线后，该时间点延长至下午15：00。因此，以当天10：30和15：00为时间截点，统计免疫流水线使用前后各1个月内（2019年3月和2019年8月）每天8：00—10：30和8：00—15：00接收的检测乙型肝炎6项血清标志物的样本在实验室信息管理系统（laboratory information system，LIS）中从申请、接收、录入、检测到审核的时间，计算乙型肝炎6项血清标志物的TAT。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。TAT以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]和90%百分位数（90%的样本完成所需的时间）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精密度

磁微粒化学发光法检测乙型肝炎6项血清标志物的实验室内变异系数（coefficient of variation，CV）均低于行业标准中的总不精密度（10%），批内s（重复性不精密度）和实验室内不精密度的结果均低于重复性不精密度及总不精密度的验证值。磁微粒化学发光法的精密度可接受。

2.2 线性范围

根据厂商声明的线性范围，每个项目均收集高（H）、低（L）值血清样本各1份，按L、4L+H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H混合，每份混合血清重复检测2次，取均值。以稀释度为横坐标，每个稀释度的测定均值为纵坐标作线性回归图。若实测值和理论值的偏差在实验室允许范围（±5%）内，则可直接判定测定方法在所涉及的浓度范围内呈线性。磁微粒化学发光法检测乙型肝炎6项血清标志物的线性回归方程分别为HBsAgY=0.942 7X-4.702 8（r2=0.993 8），HBsAbY=0.994 6X-8.823 1（r2=0.999 1），HBeAgY=1.007 9X-1.093 3（r2=0.996 9），HBeAbY=0.992 8X-0.059 9（r2=0.995 4），HBcAbY=1.008 5X-0.005 3（r2=0.998 0）和PreS1AgY=0.980 8X+1.088 0（r2=0.998 7）。见图1。

2.3 临床可报告范围

每个项目选取接近线性高值的样本各1份，按照2、4、8、16倍稀释（理论浓度），重复检测2次，计算均值（稀释浓度）。计算稀释回收率[稀释回收率（%）=稀释浓度/理论浓度×100%]，以稀释回收率在95%～105%范围内作为可接受标准。磁微粒化学发光法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb和PreS1Ag的临床可报告范围分别为0.01～400.00 IU/mL、0.57～1 948.90 mIU/mL、0.01～203.36 PEIU/mL、0.02～17.24 PEIU/mL、0.20～79.23 PEIU/mL和0.58～246.13 AU/mL，与厂商提供的临床可报告范围[0.01～200.00 IU/mL、0.57～974.45 mIU/mL、0.01～203.36 PEIU/mL、0.02～4.31 PEIU/mL、0.20～39.61 PEIU/mL、0.58～246.13 AU/mL]接近。

表1 磁微粒化学发光法检测乙型肝炎6项血清标志物的精密度

图1 磁微粒化学发光法检测乙型肝炎6项血清标志物的线性回归图

2.4 参考区间

采用磁微粒化学发光法检测20名体检健康者的乙型肝炎6项血清标志物，检测结果均落在厂商提供的参考区间内，参考区间验证通过。

2.5 检出限（limit of detection，LOD）

选取5份与厂家声明的LOD水平相等的标准物质，每天测定1次，连续测定4 d，共获得至少20个结果，如有超过95%的样本的检测结果大于厂家声明的空白限（limit of blank，LOB），检出限验证通过。厂家声明的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb的LOD分别为0.03 IU/mL、3 mIU/mL、0.04 PEIU/mL、0.04 PEIU/mL和0.4 PEIU/mL，LOB分别为0.01 IU/mL、2 mIU/mL、0.02 PEIU/mL、0.03 PEIU/mL和0.2 PEIU/mL。所有检测结果均大于厂家声明的LOB，所有项目验证通过。

2.6 样本TAT

在使用免疫流水线后，虽然2019年8月的样本量（3 113例）比2019年3月的样本量（3 742例）增加了20%，但是8：00—10：30、8：00—15：00接收的和8：00—15：00接收但当天未出报告的样本从接收到审核和从录入到审核的时间分别减少了35%、54%，42%、22%，8%、53%；90%样本的完成时间分别减少了14%、34%、79%、37%，44%、14%。与使用免疫流水线前的TAT比较，使用免疫流水线后的TAT明显缩短（P＜0.000 1）。见表2。

表2 免疫流水线使用前、后TAT的比较

3 讨论

HBV血清学标志物的检验是辅助诊断乙型肝炎的主要方法。HBV抗原和抗体常见的检测方法为化学发光法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。2种检测方法各有优缺点，ELISA操作便捷、成本较低，但易污染、灵敏度较低。CLIA较ELISA检测重复性好，灵敏度高。对于病毒载量浓度较低或处于“窗口期”的献血者，ELISA存在漏检[11]，对于在免疫耐受期等患者的高值样本，不同的CLIA检测系统对HBsAg定量检测存在偏差。因此，临床上用HBsAg进行抗病毒治疗监测时应选择同一种检测系统[12]。

目前，国内报道的性能验证研究大部分是基于美国临床实验室标准化协会的相关文件（EP15-A2、EP6-A2、EP7-A2和C28-A2等）或美国临床实验室改进修正法规进行方案设计，但有些性能指标需要根据实验室要求或本地法规自行建立，有些性能指标并无判断标准。本研究同时参照相关文件，综合确定了验证方案，对磁微粒化学发光法检测乙型肝炎6项血清标志物的各项性能指标进行了较为完整的评价。

本研究结果显示，磁微粒化学发光法检测乙型肝炎6项血清标志物的批内s、批间方差和实验室内s均符合要求，线性回归的r2值＞0.995，均符合要求。检测20名体检健康者的乙型肝炎6项血清标志物，检测结果均落在厂商提供的参考区间内，参考区间验证通过。采用磁微粒化学发光法检测与厂家声明的LOD水平相当的样本的乙型肝炎5项血清标志物，其检测结果均大于厂家声明的LOB，LOD验证通过。厂家声明的HBsAg和HBsAb的LOD分别为0.03 IU/mL和3 mIU/mL，根据WS/T 494—2017的要求，用于诊断感染性疾病抗原和抗体的测定方法的最低检出限越低越好，磁微粒化学发光法检测HBsAg和HBsAb的最低检出限应低于0.1 IU/mL和10 mIU/mL[7]，验证结果满足WS/T 494—2017的要求。

TAT是指实验室从收到样本到出具报告的时间（以min为单位）。本研究结果显示，使用免疫流水线显著提升了实验室的检测效率，TAT明显缩短，有些项目甚至缩短了79%以上。本实验室在使用免疫流水线前，每次检测乙型肝炎6项血清标志物时需凑够96人份才能上机检测，操作繁琐，而免疫流水线能做到样本随到随测，操作简便，符合实验室的预期要求和工作要求。另外，由于免疫流水线可以随时检测样本，因此本实验室把接收样本的时间延长至下午15：00点。另外，该免疫流水线能满足2 h内出报告和24 h急诊的需求，因此可以满足临床个别科室将一些传染病项目列为急诊的要求，极大的方便了患者和临床，降低了患者看病的时间成本。

综上所述，磁微粒化学发光法的关键性能指标均符合临床要求，使用免疫流水线可大幅缩短TAT，有较大的临床应用价值。