加温灭活对SARS-CoV-2咽拭子样本核酸检测结果的影响

刘 洁， 赵剑虹， 高 艳， 韩桃利， 李 丽， 孔 毅， 赵焕兴， 孙灵利， 王成彬

（1. 北京市朝阳区疾病预防控制中心，北京 100021；2. 中国人民解放军总医院第一医学中心检验中心，北京 100853；3. 中国人民解放军32382部队，湖北 武汉 432200）

引起新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）传染性强、传播速度快，目前尚无特效药物用于治疗，也无有效疫苗可以预防，给世界各国人民的健康和国家的经济发展带来了重大损害。COVID-19患者的早发现、早隔离是疫情防控最有效的方法，而作为COVID-19确诊“金标准”的核酸检测是疾病早期发现的基础。出于对SARS-CoV-2核酸检测过程中生物安全的考虑，相关实验室生物安全及核酸检测指南或专家共识都强调了核酸检测前生物样本病毒灭活处理的重要性[1-3]。虽然有文献报道加温灭活样本对SARS-CoV-2核酸检测没有影响[4]，但目前有较多临床专家提出核酸检测用于确诊COVID-19假阴性率偏高的问题，有一线检验专家提出加温灭活可能影响SARS-CoV-2核酸检测效率，从而导致了SARSCoV-2核酸检测的假阴性结果[5]。本研究拟验证样本加温灭活对SARS-CoV-2核酸检测结果的影响。

1 材料和方法

1.1 样本采集

收集采集自北京市定点医院COVID-19患者和社区密切接触者SARS-CoV-2核酸检测阳性的咽拭子样本10例。病毒采样管（货号MT0301-3）购自北京友康公司，内含3.5 mL病毒采样液，主要成分为Hank's液。

1.2 不同加热装置升温实验

选取实验室通常使用的水浴箱和空气温箱进行咽拭子样本升温实验。将室温放置的病毒采样管分别放入已经升温至56 ℃的不同加热装置中，将数据采集温度计（型号932B，美国Tegam公司）连接温度传感器微型探头（型号80141，美国Tegam公司）置于采样管内病毒采样液中，在线监测温度变化，记录从室温上升至目标温度（56 ℃）所需的时间。水浴箱、空气温箱、数据采集温度计和温度传感器均经计量机构检定和校准，并在使用前进行温度标定。

1.3 病毒灭活实验

将SARS-CoV-2核酸阳性咽拭子采样液各分装2份，一份升至目标温度（56 ℃）后加热30 min灭活（56 ℃灭活处理组），另一份室温放置作为对照（未灭活处理组）。

1.4 核酸提取和实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）

采用MagMAX Express 96全自动核酸提取仪（美国Applied Biosystems公司）及病毒DNA/RNA磁珠法提取试剂盒（批号VRNT20200112，长春博坤生物公司）提取SARS-CoV-2 RNA。采用QuantStudio5 PCR扩增仪（美国Thermo Fisher公司）及实时荧光定量PCR试剂盒（批号20200124A，上海伯杰公司）进行PCR扩增，反应体系为20 μL，加入样本核酸5 μL，体系配制和扩增条件均按试剂说明书进行。

1.5 统计学方法

采用SPSS 11.0软件进行统计分析。组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同加热装置的升温时间

空气温箱温度稳定在56 ℃时，病毒采样管中采样液由室温24.32 ℃升温至56.02 ℃用时68 min，见图1；水浴箱温度稳定在56 ℃时，采样液由室温25.37 ℃升温至56.00 ℃用时11.5 min，见图2。

图1 采样液在空气温箱内的升温曲线

图2 采样液在水浴箱内的升温曲线

2.2 不同温度灭活后的核酸检测结果

本研究共收集SARS-CoV-2阳性咽拭子样本10例，将样本平行分为56 ℃灭活处理组和未灭活处理组，同时进行核酸提取和实时荧光定量PCR扩增，结果见表1。

表1 不同温度灭活咽拭子样本后的核酸检测结果

对比SARS-CoV-2 3个不同基因位点的Ct值，可以发现加温灭活处理过的咽拭子样本核酸检测结果均会出现Ct值增加的情况，2个组ORF1a/b基因Ct值差异为2.12～7.22个循环，均值为4.25个循环；N基因Ct值差异为0.85～7.07个循环，均值为3.16个循环；E基因Ct值差异为0.6～4.54个循环，均值为2.10个循环；10例未经灭活处理的样本，经56 ℃灭活处理后，有8例样本检测结果为阳性，2例为阴性；1号和2号样本核酸浓度低，原始Ct值较高，未经灭活处理的检测结果为阳性，但经56 ℃灭活处理后，检测结果变为阴性（图3）；核酸浓度高、原始Ct值较低的样本，加温处理方式对Ct值有影响，但不影响核酸阳性定性（图4）。对未灭活处理和56 ℃灭活处理样本的ORF1a/b基因、N基因和E基因的Ct值分别进行比较，差异均有统计学意义（P=0.002、0.01、0.03），见图5。

图3 2个组低浓度样本PCR扩增结果

图4 高浓度样本PCR扩增结果（10号样本）

图5 加温处理后3个基因检测结果比较

3 讨论

目前，对于SARS-CoV-2理化特性的认识仍然来自于对严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）和中东呼吸综合症冠状病毒（middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）的研究。前期的研究结果表明，SARS-CoV和MERS-CoV对热敏感，56 ℃ 30 min可以有效灭活病毒[1]。根据现行的SARS-CoV-2核酸检测专家共识，样本在56 ℃ 45 min灭活后进行检测，可以有效降低生物安全风险，但同时也提示增加病毒灭活步骤可能会降低核酸检测的敏感性[2]。对于前期样本加温灭活是否会对SARS-CoV-2核酸检测结果造成影响，目前尚没有明确结论。

本研究评价了56 ℃ 30 min灭活对咽拭子样本SARS-CoV-2核酸检测结果的影响，发现与未灭活处理样本比较，加温处理过的咽拭子样本，核酸检测结果Ct值会增加，或PCR曲线峰型不佳，可能造成低载量样本出现假阴性结果。这一发现与之前文献报道[4]结果不一致。应该注意以下2点：（1）需要明确灭活的温度和时间。之前对于样本灭活只是笼统地建议56 ℃30～45 min，但本研究发现，不同升温装置将样本从室温加热到56 ℃的时间有很大的差异，而不同样本量达到目标温度的时间可能也会不同。如果使用空气温箱加温，将单支样本放入温箱后30 min或45 min，样本内部尚不能达到56℃，在此情况下进行核酸检测，不仅不能保证病毒的灭活达到生物安全要求，而且还可能影响病毒核酸的提取和扩增。即使用对样本加温较快的水浴箱，单支采样管内的温度从室温升至56 ℃也需要超过10 min。如果大批量样本一起加温，升温速度会受到更大的影响，并且样本在升温装置中不同的摆放方式和位置对升温速度的影响如何也未进行过验证，这些都是我们在实际工作中需要验证和考虑的。（2）病毒采样液的选择。本研究使用的病毒采样液是日常工作中最常用的Hank's液，有研究发现使用Hank's液保存的猪流行性腹泻冠状病毒样本经过56 ℃孵育30 min后，冠状病毒核酸损失了50%，而加热到92 ℃后5 min，可检出的冠状病毒核酸损失超过96%[6]，与本研究结果一致。这是否意味着冠状病毒的核酸结构对热具有不稳定性，或者还受其他因素的影响，有待于进一步研究。