糖苷类化合物非水相生物催化结构修饰的研究进展

杨荣玲，吴婷婷，赵祥杰，聂泽坤，王朝宇

(淮阴工学院 生命科学与食品工程学院，江苏 淮安 223003)

糖苷是糖的半缩醛羟基与配体缩合而形成的含糖衍生物，糖基一般为单糖或多糖，而配体的结构可以是简单的中等长度的脂肪醇，也可以是复杂的生物大分子如蛋白质[1]。糖苷类化合物广泛存在于自然界中，具有多种生理活性，在生物、医药、食品、化妆品等领域均有着广阔的应用前景。但糖苷类化合物普遍存在着稳定性低、脂溶性差等缺点，可以通过对糖苷类化合物分子进行结构修饰和分子改造，增加其结构和功能的多样性，改善糖苷类化合物脂溶性和稳定性等，大大提升其生物利用度。

结构修饰方法以化学法和生物催化法为主，目前化学法应用较为广泛，但反应往往选择性差，反应体系易造成环境污染，反应产物复杂且分离纯化较为困难。生物催化法则以酶法为主，酶法较化学法具有条件温和、专一性强等优点，因此越来越受到人们的关注。传统上认为酶催化反应是在水介质中进行的，但许多有机化合物底物在水中的溶解性较差。随着对酶的深入研究，发现酶催化反应也能在非水相系统中进行[2]。酶在非水介质中催化反应相较于水相的优点很多，诸如能催化在水中不能进行的反应、可以提高酶的热稳定性、酶和产物易于回收、可避免微生物污染等[3],因此，非水相催化酶学研究已成为酶学、酶工程的一个重要方向。目前，通过非水相生物催化对糖苷类化合物进行结构修饰已引起国内外学者的广泛关注，新型催化剂的设计与应用和基于溶剂工程的新型溶剂体系的引用带动了非水相催化研究地不断深入，多种糖苷类化合物获得结构修饰并产生了新的性状[4]。作者从催化剂种类、催化介质、结构修饰的方法、结构修饰对功能的影响及其应用等方面对非水相生物催化糖苷类化合物结构修饰的现状进行综述，展现出结构修饰在改善糖苷类化合物脂溶性和稳定性方面良好的研究前景。

1 非水相生物催化

1.1 催化剂种类

1.1.1游离酶 游离酶是处于游离状态的酶分子，是催化反应中最常见的一种酶制剂形式,易溶于水，与底物作用面积大。在生物催化反应中使用纯酶能够对所选反应具有特异性，装置和操作简单并且对用于增溶的共溶剂具有更高的耐受性[5]。因此，在一步反应中，使用纯化的游离酶显示出较高的专一性，不会发生副反应，并且底物不必跨膜转运。随着蛋白质和基因工程技术的发展，推动了纯酶制剂的应用。其中，用于糖苷结构修饰的糖苷酶几乎存在于一切生物体中，其底物适应性宽，可直接以非保护或非活化的糖作为糖基供体直接催化合成糖苷类物质，如β-糖苷酶可用于红景天苷的合成[6]，苦杏仁苷酶可用于芳香基葡萄糖苷的合成[7]，β-葡萄糖苷酶可用于烷基及芳基糖苷的合成[8]，α-葡萄糖苷酶可用于槲皮苷的合成[9]，二糖苷酶可用于陈皮苷的水解[10]。然而，酶的分离和纯化可能非常昂贵并耗时，反应过程中可能需要添加辅因子，反应结束后需要对酶进行回收利用，有些反应可能需要多种酶共同完成，这些都是应用过程中的困难，限制了游离酶的使用。

1.1.2固定化酶 游离酶因具有的高催化活性、选择性、特异性和可生物降解性而深受青睐[11]，但存在不能回收和再利用难题[12],而通过将酶固定化则使酶容易回收。固定化酶是指通过物理或化学法把酶束缚在一定空间内且仍具有酶活性的一种酶制剂，固定化酶易于与底物分离，可以实现酶促反应快速终止，也能重复进行酶反应，从而显著降低测定成本，还能提高储存稳定性，pH稳定性和耐热性,已被广泛应用于制药工业、食品工业、污水处理和纺织工业等各个领域。Kontogianni等[13]以芦丁、柚皮苷为底物，3种不同链长的脂肪酸酯为酰基供体，在南极念珠菌脂肪酶的催化下合成了一系列类黄酮脂肪酸酯。Patil等[14]选用来自荧光假单胞菌的脂肪酶AK，催化穿心莲内酯合成了2种更具抗菌活性的穿心莲内酯-14-丙酸酯和穿心莲内酯-14-己酸酯。但同时，固定化酶也存在固定化操作损失酶活力，不适宜于多酶反应体系，不适合与大分子物质反应，固定化制备成本高等缺点。

1.1.3全细胞催化剂 全细胞催化剂是利用完整的微生物细胞作为催化剂进行生物转化反应。全细胞催化剂的酶活性高且稳定性强，通过细胞培养即可获得，操作简单，同时也避免了分离纯化等步骤，能显著降低酶制剂的使用成本。Tufvesson等[15]在生物催化剂的成本研究中发现，纯化酶比全细胞催化剂贵10倍。此外，相比于单一纯酶只能进行一步或一类反应，全细胞催化剂能够完成多步反应[5]。全细胞催化剂最主要的优点是能够给酶提供一个天然环境，使酶对于体系中水分含量的要求不苛刻，同时更具稳定性从而避免酶在非水溶剂中快速失活[16]。随着对全细胞催化研究的不断深入，新型全细胞催化剂也不断地被发现。目前，全细胞催化剂已被广泛应用于生物柴油生产、手性分子拆分、核苷类化合物酰化修饰等方面[5,17]。

全细胞催化剂已经在生物柴油工业化生产中得到广泛使用，可以减少生物柴油生产过程中的操作步骤，易于分离副产物甘油，显著降低了生产成本[18]；由于全细胞催化剂具有高度的对映选择性和区域选择性，在手性化合物生产中有越来越多的应用[5]，如Ye[19]等研究了重组全细胞催化剂在磷酸钾缓冲液和丁酸乙酯双相体系中催化合成手性药物中间体(S)-4-氯-羟基丁酸乙酯。此外，核苷类化合物作为在抗病毒和抗肿瘤等方面的重要药物，已经越来越多地被利用全细胞催化剂合成。Feng等[20]利用葡萄糖和丙酸乙烯酯在施氏假单胞菌冻干细胞的催化下成功合成了6-O-丙酰基-D-葡萄糖，反应具有较高的转化率(97.2%)和6-区域选择性(>99%)。练妍[21]利用荧光假单胞菌和米曲霉全细胞为催化剂成功催化5-氟尿苷与月桂酸乙烯酯合成了5-氟尿苷酯。Yang等[22]利用米曲霉全细胞催化剂在异丙醚-吡啶体系中催化合成阿糖胞苷的3′-O-丙氨酸衍生物，转化率达到83%。胡霞艳[23]以毕赤酵母表面展示DC-BGL为催化剂，首先将葡萄糖逆水解生成丁基β-D葡萄糖苷(BD)，再以BD为糖基供体，正辛醇为糖苷供体，转糖苷合成辛基β-D葡萄糖苷(OG)，转化率最高为51.1%。虽然全细胞催化比酶催化具有更经济、更环保的优势，但存在催化反应的不确定性、细胞膜对底物的透过性差异以及副产物的累积等缺点[24]。

1.2 非水相介质体系

1.2.1有机溶剂体系 有机溶剂中的酶催化指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。自1984年Zaks和Klibanov研究发现脂肪酶在有机溶剂中存活，并具有较高的热稳定性和催化活性后，酶在有机溶剂中的催化作用取得了快速发展[25]。酶在有机溶剂中的催化反应已成为生物技术领域的一个主要研究领域，受到国内外学术界的广泛关注[26]。有机溶剂体系中的酶能够催化在水溶液中受热力学限制而不能进行的反应，有机溶剂中酶促反应条件温和，酶的稳定性大大提高，并可防止因水引起的酶水解副反应，大幅减少副产物，使得目标产物分离更为容易。Yang等[27]利用Lipozyme TLL在四氢呋喃中催化合成了一系列豆腐果苷脂肪酸酯衍生物，区域选择性大于99%。

1.2.2无溶剂体系 无溶剂体系是酶催化反应中无需加入其他有机溶剂，酶直接作用于底物的反应体系，可作为取代传统有机溶剂最彻底的绿色方法[28]。无溶剂体系具有底物浓度高、反应速度快等特点，且无需分离反应溶剂，减少了产物分离提纯的步骤，使纯化容易，同时降低了对环境的污染。在无溶剂体系中，通过适当提高反应温度可提高酶反应速率。

1.2.3离子液体体系 离子液体实质上是凝固点较低，室温下呈液态的盐。离子液体有着较低的蒸气压、高稳定性以及环境友好等特点，是一种新颖的绿色溶剂[29]。离子液体通常按阴阳离子分类，也可按水溶性分为亲水性和憎水性离子液体，此外，还可按酸碱性分类。为了研究离子液体对酶活性和稳定性的影响，合成了各种各样的亲水性和疏水性离子液体[30]。在大多数情况下，疏水离子液体因能对酶分子起保持稳定性的作用，使其在酶促反应中表现出更好的性能[31]。

离子液体作为有机溶剂的绿色替代品，最近成为各种生物催化过程的新型有效溶剂，开辟出一个新兴的非水相酶学领域，在生物催化领域成为研究热点。Yang等[17]研究出新的含有离子液体[BMI] [PF6]/THF的反应体系，利用荧光假单胞菌全细胞催化剂催化合成了长链核苷酸酯，产物收率达到81.1%，5′-区域选择性大于99%。

1.2.4超临界流体介质体系 超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体，研究表明：利用超临界流体作为酶催化亲脂性底物的溶剂时，酶相对稳定并可用于催化酯化、水解、转酯等反应[32]。常用的超临界流体有CO2、H2O、NH3、C2H4等，其中超临界CO2流体价廉、无毒，反应物具有较高的扩散度和相对较低的黏度，同时底物更易溶解，反应速率更快，因此适用于酶催化反应的进行。但该体系需要使用高压容器，减压时易使酶失活[33]。此外，超临界CO2也可能会和酶分子表面的活泼基团发生反应从而导致酶活性的丧失。

2 糖苷类化合物结构修饰的现状

2.1 糖苷类化合物结构修饰方法

2.1.1去糖基化修饰 糖苷类化合物是由苷元和糖基通过不同糖苷键连接而成，通过去糖基化修饰得到的苷元较糖苷亲脂性更高,更易进入生物膜疏水层的内核，从而改变其生物活性。研究表明：黄酮糖苷经去糖基化修饰形成黄酮苷元，其清除自由基的能力以及抗氧化活性与黄酮糖苷相比更优，生物利用率大大提高[34]。橙皮苷的苷元具有镇痛、抗炎、抗氧化等特性，还能作为生产染料和甜味剂的基本原料[10]。然而，糖基化黄酮类化合物的低溶解度是在水性介质中进行有效地酶促去糖基化的障碍。为了克服这个缺点，通常使用对环境不友好的二甲基亚砜(DMSO)作为共溶剂。近年来，低共熔溶剂(DES)作为一种新型绿色、溶解度好的反应介质引起了学者的广泛关注，Weiz等[10]选用二糖苷酶在由氯化胆碱和甘油或乙二醇组成的DES中对橙皮苷进行去糖基化修饰，显示出较高的类黄酮溶解度和高酶活性。

2.1.2糖基化修饰 天然产物通过糖基化、乙酰化、甲基化等修饰方法可提高结构的复杂性和多样性，在一定程度上可改善天然产物的成药性，其中糖基化修饰对增加溶解性和稳定性的效果极为显著[35]。糖基化修饰是指利用糖基转移酶将葡萄糖基转移到糖苷类化合物的母体或糖基上以达到修饰的目的。天然糖苷类化合物经糖基化修饰能增加结构和功能的多样性，还可以增加其溶解度，提高生物利用度，减少毒副作用，形成高活性及低毒性的天然活性先导化合物。Ko等[36]选用来自蜡状芽孢杆菌的UDP-糖基转移酶对柚皮素的4-羟基上进行糖基化修饰，得到柚皮素-4′-O-葡萄糖苷，溶解性得到提高。Malla等[37]在大肠杆菌中引入大豆中的糖基转移酶，以柚皮素为底物，合成了山奈酚-3-O-葡萄糖苷，研究表明，其能抑制雌二醇代谢生成的4-羟基雌二醇致癌代谢物，具有抗肿瘤作用，但其抑制效果比山奈酚有所降低[38]。由此可见，糖基化修饰主要作用是增加产物溶解度。目前，对天然糖苷类化合物的糖基化修饰已经成为当今新药研制领域的热点。

2.1.3酰化修饰 酰化修饰是通过引入一个或多个有机酸分子与化合物糖苷基团上的羟基进行反应形成不同取代的酰基糖苷。酶法酰化是糖苷类化合物结构修饰的一种有效手段，其反应条件温和，在常温下能高效催化酰化反应，并可定向合成具有特定结构的酯类衍生物。当糖环的羟基连接上脂肪族或芳香族酰基时，可增强化合物的脂溶性，提高糖苷化合物的利用度。

黄酮苷类化合物可通过南极假丝酵母脂肪酶B和枯草杆菌蛋白酶在黄酮糖苷上糖基的醇羟基位点进行酰化修饰以提高其亲脂性并引入各种有益的性能[39]。柚皮苷作为一种双羟基黄酮类化合物，主要存在于葡萄柚和柑橘类水果中，具有抗氧化、抗炎、保肝等生物活性，因此受到了医药和功能性食品工业的广泛关注。然而，柚皮苷的实际应用因其在脂质环境中溶解度和稳定性较差而受到限制[40]。Zhang等[40]选用固定化脂肪酶(Novozym 435)作为催化剂，将柚皮苷与棕榈酸在叔戊醇、丙酮和正己烷3种溶剂中进行酰化反应，均成功得到了柚皮苷棕榈酸酯，且在叔戊醇中转化收率最高。

熊果苷作为一种简单的多酚，可以从多种天然植物中提取，并具有各种重要的生物活性。含有熊果苷的植物物质主要用于治疗尿路感染，部分研究发现熊果苷具有阻止黑色素生成的活性，可用于治疗色素沉着过度[41]。此外，通过熊果苷结构的改变可导致上述活性的增加。Yang等[41]选用扩展青霉脂肪酶成功地合成了一组新的芳香族酯类熊果苷，其具有优良的6′-区域选择性(>99%)和较好的分离产率(68%～93%)。Jiang等[42]以乙酸乙烯酯为酰基供体，假丝酵母脂肪酶为催化剂，在四氢呋喃有机溶剂体系中催化熊果苷区域选择性酰化反应(图1)，在熊果苷的葡萄糖部分的C-6′位置显示出高度特异性，反应24h后转化率可达(91.42±2.43)%。

图1 假丝酵母脂肪酶催化熊果苷区域选择性酰化反应[42]

2.1.4甲基化修饰 通过在糖苷分子酚羟基引入醇羟基并缩合，形成甲基化修饰的糖苷可以提高糖苷类化合物的生物活性，提高生物利用度。黄酮类化合物甲基化修饰具有空间选择专一性。橙皮苷3′位酚羟基被甲基化生成甲基橙皮苷，其水溶性好，以其为原料的药物可防止动脉硬化所引起的血管紊乱[43]。目前利用非水介质对糖苷类化合物进行甲基化修饰的研究相对较少。

2.2 结构修饰对糖苷类化合物性质的影响

2.2.1溶解度提高 糖苷类化合物通过结构修饰可有效增强其水溶性，提高其在人体内的代谢活性。Calias等[44]研究发现槲皮素通过糖基化修饰后，其水溶性提高了30多倍，抗肿瘤活性也得到增强。酰化修饰在改变糖苷类化合物多羟基结构的同时，不仅可以改善其水溶性，还可提高其脂溶性，提高细胞膜的亲和力，从而提高其生物利用度。Cruz等[45]在研究测定儿茶素、原花青素B4和锦葵花素-3-葡萄糖苷的酯类衍生物抗氧化活性的同时发现其均具有脂溶性强的优点，可促进该类衍生物运输到细胞目标物，提高其生物利用度。袁亭亭[46]测定了葛根素及其酯类衍生物的正辛醇-水分配系数，发现油水分配系数都较亲代化合物有所增加，并随酰基供体链长的增长而逐渐变大，有效地证明了酰化修饰可增加亲代化合物的脂溶性。

2.2.2稳定性增强 与微胶囊化包裹技术实现糖苷类化合物稳定性提升的机理不同，经结构修饰后的糖苷类化合物主要受到修饰基团的影响，减轻了介质水对母核的作用而产生的基团重组，从而保持了其结构稳定性[47]。花青素作为一种色素广泛分布于植物体内，具有抗癌抗肿瘤、保护视力、调节血脂等多种功效，但由于稳定性较差限制了其广泛应用,而通过酰化作用得到的多酰基化修饰的花青素分子，可以在疏水作用力的影响下使花青素母核分子夹在酰基基团形成的层状结构中间，形成类似于“三明治”的结构，可以提高花青素的稳定性，扩大花青素的应用范围，但花青素的酰化位点以及酰基类型、数量和性质的不同均会对酰化花色苷的稳定性产生不同程度的影响[48]。Yan等[49]利用南极假丝酵母脂肪酶B对黑米中花色苷进行酶促酰化，成功合成了矢车菊素-3-6″-苯甲酰葡萄糖苷、矢车菊素-3-6″-水杨酰葡萄糖苷和矢车菊素-3-6″-肉桂酰葡萄糖苷(图2)，酰化修饰产物的稳定性均得到改善，其中肉桂酰化后的产物稳定性最好。

图2 飞燕草素3-葡萄糖苷(1)及其3种酰化衍生物的结构[49]

2.2.3生物活性提升 糖苷类化合物通过结构修饰不仅可以改善其溶解度和稳定性，还可增强其功能的多样性，提高其生物活性。通过结构修饰能够有效增强糖苷类化合物的抗氧化活性。李路宁等[50]通过测定酰化蓝莓花青素清除自由基、清除超氧阴离子和抑制脂质体过氧化的能力，发现没食子酸酰化花青素的抗氧化性可得到有效提升。霍彦雄等[51]通过固定化酶催化合成根皮苷豆蔻酸酯，其抑制脂质氧化、清除H2O2和HClO能力明显要优于亲代化合物，说明结构修饰可提高亲代化合物的体外抗氧化能力。

2.3 糖苷类结构修饰化合物的应用

糖苷类化合物在天然环境中的来源非常丰富，且具有多种生物活性，因此在食品、医药、日化、印染、农药等领域具有较为广泛的应用。而通过对天然糖苷类化合物进行结构修饰，改善其脂溶性、稳定性以及生物活性，可以更加拓宽其应用领域，并能取得更优的使用效果。Xanthakis等[52]通过酰化反应生成芦丁酯类衍生物，检测其对人类白血病细胞K562生成VEGF的影响，发现芦丁酯类衍生物具有抗血管生成特性，在肿瘤防治中具有潜在的应用前景。熊果苷的衍生物6′-O-咖啡酰基熊果苷较亲代化合物抑制黑色素能力更强、毒性更弱的特点，能够起到美白淡斑的功效，在化妆品和医药领域具有应用前景[53]。拥有防治心脑血管疾病的葛根素目前已用于临床治疗，但其脂溶性差，不易透过血脑屏障，导致药物利用度低，葛根素经酰化修饰得到的乙酰葛根素脂溶性得到明显增加，能够抑制细胞凋亡，起到神经保护作用[54]。

3 展 望

利用非水相介质对糖苷类化合物进行结构修饰已取得可喜进展，通过去糖基化修饰、糖基化修饰、酰化修饰、甲基化修饰等方法可有效改善糖苷类化合物的脂溶性、稳定性等特性。但是，许多研究工作仍停留在实验室阶段，转化率较低极大地限制了糖苷类化合物的工业化生产。针对当前结构修饰研究中存在的困境，一方面要筛选具有高催化活性和稳定性的催化剂，可以通过从植物来源和微生物来源中筛选专用催化剂，也可以通过分子生物学和酶工程方法进行重组和改造酶，获得具有较高实用价值的催化剂；另一方面也可以设计或筛选性质优良的催化介质，如新型低共熔溶剂和离子液体的设计等，从而改善非水相条件下糖苷类化合物的结构修饰性能。通过进一步的努力，非水相生物催化糖苷类化合物结构修饰技术必将取得惊人的进步。