急性脑梗死患者外周血Th17、Treg、Th17/Treg及炎症因子的动态变化过程研究

刘洁，胡小辉，龚道恺

急性脑梗死(AIS)能激活一系列炎症细胞、细胞因子及趋化因子等，从而加重神经损伤，影响预后[1]。其中，辅助性 T细胞17(Th17)和调节性 T 细胞(Treg)是保持相对平衡的T淋巴细胞亚群；但是，Th17和Treg细胞平衡一旦打破，能加剧疾病的发展[2]。另外，IL-6、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)、C反应蛋白(CRP)和红细胞沉降率(ESR)等是临床上常用来评估全身炎性反应的指标[3]。目前缺乏Th17、Treg及Th17/Treg平衡与AIS炎症反应关系的研究。因此，本研究旨在阐述外周血Th17、Treg及Th17/Treg平衡和炎症因子动态变化情况，并分析其在AIS患者中的免疫调节作用。

1 对象与方法

1.1 对象 纳入2019年1月至2019年8月荆州市中心医院神经内科住院治疗的急性动脉粥样硬化性AIS患者32例，其中男19例，女13例；年龄为39～81岁，平均(63.1±10.7)岁。纳入标准:(1)所有患者均符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》诊断标准，并经头颅CT 和(或)MRI证实诊断；(2)发病48 h内入院治疗；(3)首次发病。排除标准:(1)存在脑血管动脉瘤、心源性脑栓塞、静脉窦血栓、动静脉畸形、夹层、动脉炎及烟雾病的患者；(2)住院期间合并感染者；(3)合并急性心肌梗死、严重肝肾疾病、恶性肿瘤、内分泌疾病、血液循环系统及免疫系统疾病；(4)近期4周内存在感染、骨折外伤、手术及服用抗炎药物、免疫抑制剂。对照组为同期健康体检者，共32名，其中男14名，女18名; 年龄为30～78岁，平均(59.5±11.2)岁。均排除脑血管病、心肌梗死、糖尿病、恶性肿瘤、内分泌疾病及自身免疫性疾病，近期4周内无感染、骨折外伤、手术，未服用抗炎药物及免疫抑制剂。对照组与AIS组间在性别和年龄方面差异均无统计学意义(均P>0.05)。本研究获得知情同意并经医院伦理委员会批准通过。

1.2 方法

1.2.1 采血及实验室检查 所有AIS患者给予常规治疗。于住院后第1 d、4 d、7 d清晨，分别使用 EDTA 抗凝管采取空腹外周肘静脉血5 ml，平均分为两管，并在6 h内进行流式细胞术检测Th17、Treg比例。抽静脉血在3 h内，用Sysmex XN-1000全自动血液分析仪检测血常规，并计算中性粒细胞与淋巴细胞比值。采用赛科希德SD-100动态血沉压积测试仪测ESR，并采用电化学发光法测IL-6，免疫比浊法测CRP。

1.2.2 主要试剂和设备 Anti-CD127-PE-Cy7抗体、Anti-IL-17A-PE抗体、Leukocyte Activation Cocktail细胞刺激阻断剂(含有佛波醇酯、离子霉素和蛋白转运抑制剂)、Cytofix/Cytoperm 破膜固定试剂盒均购自于美国BD公司。Anti-CD25-PE抗体、Anti-CD4-FITC抗体购自于美国Biolegend 公司。OptiLyse C溶血素、Epics-XL流式细胞仪均购于美国Beckman Coulter公司。

1.2.3 Th17的检测方法 取新鲜无菌EDTA-K2抗凝全血和PRMI 1640培养液各200 μl混匀，加入细胞刺激阻断剂1 μl置于37 ℃、5% CO2刺激培养5 h；加入Anti-CD4-FITC 5 μl，室温避光孵育20 min；加入溶血素，室温避光孵育10 min；加入1 ml PBS，避光静置5 min 后，1 500 r/min 离心5 min，倒上清液；加入500 μl破膜固定剂避光20 min，离心去上清液。加入稀释后的缓冲液Wash buffer 2 ml，室温避光静10 min，离心去上清液。加Wash buffer 100 μl，加Anti-IL17A-PE 20 μl，室温避光孵育30 min。加Wash buffer 2 ml，离心去上清液后，加入0.5 ml PBS 重悬细胞，应用流式细胞仪，以淋巴细胞群设门，对 CD4+T 细胞分泌IL-17A的Th17进行检测。

1.2.4 Treg的检测方法 在流式管中加入Anti-CD4-FITC、Anti-CD25-PE及Anti-CD127-PE-Cy7各5 μl；再加入EDTA-K2全血100 μl，混均，避光孵育20 min; 加入OptiLyse C溶血素0.5 ml，混匀，避光孵育10 min; 加入1 ml PBS，避光静置5 min后，1 500 r/min 离心 5 min，倒上清液后，加入0.5 ml PBS 重悬细胞，应用流式细胞仪，以淋巴细胞群设门，检测CD4+CD25+CD127-调节 T 细胞占CD4+T 细胞的百分率。

2 结 果

2.1 AIS组早期外周血Th17、Treg的表达及Th17/Treg比值动态变化情况 见表1。AIS组第1 d、4 d，患者外周血Th17比例明显高于对照组(P<0.05)；第7 d患者外周血Th17比例减小，与对照组比较，差异无统计学意义(P=0.114)。外周血Treg比例在第1 d明显低于对照组，第4 d Treg比例增高，但仍低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；第7 d患者外周血Treg比例继续升高，恢复至对照组水平，差异无统计学意义(P=0.507)。AIS患者外周Th17/Treg比值在第1 d、4 d、7 d逐渐减小，但均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 AIS组外周血Th17、Treg比例及Th17/Treg变化[M(IQR),n=32]组别Th17(%)Treg(%)Th17/Treg对照组4.47(3.80)3.56(1.04)1.31(1.00)AIS组 1d7.31(3.67)△2.90(1.78)△2.75(2.56)△ 4d7.69(3.05)△3.14(1.41)△2.56(1.89)△ 7d5.69(2.47)3.32(2.43)1.77(1.08)△ 注:与对照组相比△P<0.05

2.2 AIS组早期炎性指标IL-6、NLR、CRP及ESR动态变化情况 见表2。AIS组第1 d、4 d、7 d，IL-6逐渐减低，但均高于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。NLR和CRP在AIS后第1 d高于对照组，第4 d继续增高，第7 d有所下降，整个过程持续高于对照组(均P<0.05)。ESR在AIS后第1 d，与对照组比较，无统计学意义(P=0.278)；第4 d明显高于对照组(P<0.05)，第7 d有所下降，但高于对照组(P<0.05)。

2.3 AIS组Th17及Treg细胞比例、Th17/Treg、NLR、CRP、ESR水平分别与IL-6的相关性分析 见图1。AIS患者第1 d、4 d、7 d外周血Th17比例及Th17/Treg、NLR、CRP、ESR分别与IL-6呈正相关(ρ=0.298，P=0.007；ρ=0.351，P=0.001；ρ=0.377，P=0.001；ρ=0.582，P=0.000；ρ=0.388，P=0.000)；Treg比例与IL-6呈负相关(ρ=-0.242，P=0.029)。

表2 AIS组IL-6、NLR、CRP、ESR的变化[M(IQR),n=32]组别IL-6(ng/L)NLR CRP(mg/L)ESR(mm/h)对照组1.50(1.26) 1.68(1.33) 0.56(0.78)12.0(9.0)AIS组 1d6.76(12.43)△2.59(2.40)△2.27(5.38)△13.0(11.0) 4d5.03(9.38)△3.01(2.19)△5.04(7.02)△23.0(19.5)△ 7d4.27(3.38)△2.66(2.91)△4.63(9.01)△18.0(23.0)△ 注:与对照组相比△P<0.05

图1 AIS患者Th17及Treg细胞比例、Th17/Treg、NLR、CRP、ESR水平分别与IL-6的相关性分析；ρ为相关系数

3 讨 论

AIS发生后局部炎症可迅速激活全身性炎症级联反应，从而诱发脑组织的二次损伤[4]。Th17是参与组织炎症和自身免疫的主要细胞类型，Treg则介导免疫耐受、防止脑组织损伤，因此Th17/Treg细胞的平衡是AIS缺血性脑损伤的重要决定因素[5]。探索AIS早期外周免疫状态，有助于了解疾病的发展过程。

Th17和Treg都起源于CD4+T淋巴细胞，不仅在功能上相互拮抗，而且在细胞分化上可以相互影响和转化[6]。Th17分泌的细胞因子可以影响Treg分化形成，加剧脑损伤；与此同时，Treg也可以通过转录的特异性Foxp3抑制Th17分化和IL-17表达，发挥抗炎作用[7]。因此，Th17/Treg可以反映这两类细胞外周免疫平衡状态。已有研究表明，Th17和Treg参与了动脉粥样硬化的形成，而且Th17/Treg的失衡可诱导斑块破裂或内皮侵蚀，最终导致血栓形成[8]。但是，目前缺乏人外周血Th17、Treg 的表达与AIS病情进展的动态研究。本研究结果显示，在AIS后的第1 d，Th17显著升高，而Treg表达受到抑制，Th17/Treg的平衡被打破，说明早期炎症反应以促炎反应为主，免疫保护作用减弱。随后，Th17逐渐减少，Treg表达逐渐增多，并在AIS第7 d基本恢复至对照组水平。表明随着机体免疫调节，Treg抗炎作用增强，限制Th17表达。但此时，与对照组相比，Th17/Treg紊乱仍然存在，说明在AIS后的第7 d细胞免疫稳态尚未完全恢复。由此可见，比起Th17和Treg，Th17/Treg能反映AIS后的免疫平衡状态。

IL-6可以由小胶质细胞、淋巴细胞、内皮细胞等多种细胞分泌，介导、参与AIS的全身炎性反应[9]。IL-6不仅能促进初始T淋巴细胞向Th17分化，还能使扩增的Treg转化为效应Th17，干预Th17/Treg的平衡调节[10]。本研究发现，AIS患者血清中IL-6的水平与Treg的表达呈负相关，而与Th17水平呈正相关。这与Li等的研究结果一致[11]。而且，本研究进一步证实，IL-6在AIS后的第1 d表达水平最高，之后表达逐渐降低，第7 d时IL-6水平仍高于对照组，这一变化趋势与Th17/Treg一致。而且，IL-6水平与Th17/Treg呈正相关，说明IL-6可能参与了AIS外周细胞免疫稳态调节的全过程。

NLR是简单易行的新型炎性标志物，与AIS缺血灶体积大小密切相关[12]。AIS局部的促炎介质可迅速释放到体循环中，中性粒细胞大量激活，并分泌基质金属蛋白酶9破坏血-脑屏障，从而诱导周围炎症因子和细胞浸入脑实质[13]。同时，交感神经的过度反应导致成熟淋巴细胞凋亡，AIS患者处于免疫抑制状态，增加感染机会[14]。本研究发现NLR脑卒中第1 d升高，在第4 d达到高峰，此后缓慢降低，因此推测AIS早期高水平的NLR有神经功能损伤的风险，并且容易合并感染。IL-6能诱导肝脏合成CRP[15]，并与CRP水平呈正相关，但并不完全同步增长，CRP表达高峰可能出现滞后现象(表2)。ESR是非特异性炎性标志物，尽管灵敏度和特异性不高，但可以联合其他炎症指标，共同评估动脉粥样硬化狭窄程度和AIS不良预后[16-17]。ESR、NLR及CRP三者变化趋势基本一致，即逐渐上升再下降，并且均与IL-6的表达水平密切相关。因此推测，IL-6、NLR、CRP及ESR在AIS患者全身炎症反应中发挥重要作用。

综上所述，外周Th17、Treg参与AIS发生和发展过程；IL-6不仅可作用于Th17/Treg平衡的调节，还能与ESR、NLR及CRP共同反映了AIS患者全身炎症动态变化情况。临床上，采用多个炎症指标联合更有利于 AIS的早期诊断、病情变化的判断。