螺旋藻多糖对急性酒精中毒小鼠肝、心、肾、胸腺抗氧化损伤的研究

陈帅行， 马浩天， 李润植， 葛保胜， 崔红利

(1. 山西农业大学 分子农业与生物能源研究所， 太谷 030801; 2. 中国石油大学(华东) 生物工程中心， 青岛 266580)

急性酒精性中毒会引起体内代谢水平失衡，致使细胞膜完整性受损，收缩蛋白功能障碍，细胞器功能失常，导致肾脏损伤、肝损伤以及降低机体的免疫力[1-4]。预防酒精性损伤中最为重要的一条是戒酒，戒酒可以改善肝损伤的程度。纳曲酮和类固醇是一种纯阿片样物质拮抗剂，可以控制嗜酒者对酒精的渴望，但同时会对肝细胞造成损伤，长期服用也会对患者产生副作用。多糖可以作为新的药物在急性酒精诱导的机体损伤下，有效降低其体内的活性氧，缓解急性酒精引起的损伤[5-8]。

螺旋藻多糖是从螺旋藻中分离出来的生物活性物质之一，可延缓疲劳、增强机体免疫力、降低血脂和血压水平[9-13]。螺旋藻及其产品还具有治疗记忆力损伤、减轻了二嗪农(DZN)的毒性作用，保护砷(AS)对大鼠睾丸氧化损伤的作用[14]，而且螺旋藻对砷诱导的大鼠睾丸氧化损伤具有一定的保护作用[15]，以上结果表明螺旋藻作为药物治疗有显著的效果。近年来对其抗氧化作用的研究已经不断深入，但用它治疗酒精性损伤的案例未见报道。本文利用50%乙醇代替酒精建立酒精心脏、胸腺、肾脏、肝的酒精损伤模型，钝顶螺旋藻多糖为治疗药物，以联苯双酯作为阳性对照来研究螺旋藻多糖对小鼠急性酒精性肾脏、心脏、胸腺及肝损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

两月龄雄性小鼠30只，体重(22±2)g，由山西医科大学实验动物中心提供，标准啮齿类动物饲养笼、饲料(苏州新区枫桥净化设备有限公司)、钝顶螺旋藻多糖(纯度 98%) 购自西安斯诺特生物技术有限公司、联苯双酯片(北京协和药厂H50021197)；丙氨酸氨基转移酶试剂盒(C009-3)、天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒(C010-3)、丙二醛试剂盒(A003-1)、过氧化氢酶试剂盒(A007-2)和谷胱甘肽试剂盒(A006-1)总蛋白定量试剂盒(A405-3)均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 小鼠醉酒和酒醒鉴定参考文献[16]。在第22天除正常组外，均灌胃12 mL/kg的50%乙醇，灌胃后，将其背向下放置鼠笼内，其背向下姿势保持30 s以上，判定为醉酒，12 h后100%小鼠酒醒，处死，取肝、心、肾及胸腺组织，研磨取上清备用。

1.2.2 动物分组和模型建立

30只小鼠随机分组为空白组(生理盐水)、模型组(生理盐水)、阳性对照组(联苯双酯150 mg/kg·d)、低剂量螺旋藻多糖组(100 mg/kg·d)、高剂量螺旋藻多糖PSP组(300 mg/kg·d)，每天灌胃1次，共灌胃21 d，实验期间提供全价的颗粒饮料和饮用水，第22天除空白对照组外，其余4组均用(12 mL/kg)50%乙醇灌胃建立急性酒精性肾脏、心脏、胸腺、肝脏损伤模型，空白小组灌等体积的生理盐水。12 h后(无小鼠死亡)每组小鼠均颈椎脱臼处死，解剖取肾脏、心脏、脾脏及胸腺测定抗氧化指标。

1.2.3 血清中 ALT和AST的测定

小鼠摘眼球取血，血液室温下放置10 min，自然凝集后，3000 r/min 离心10 min，分装血清、备用。血清中 ALT、AST 测定照试剂盒操作。

1.2.4 组织匀浆和酶液制备

将解剖好的脏器放置-20 ℃保存，以便测定组织抗氧化指标，准确称取1 g肝、心、肾、胸腺组织，使用9%的生理盐水冲洗组织表面的血液，拭干，冰浴条件下用手术刀切碎组织，研磨至匀浆，加入生理盐水，移入到1.5 mL离心管中，在4 ℃条件下3500 r/min离心，取上清液用于测定抗氧化指标。

1.2.5 检测方法

测试CAT、GSH、MDA、ALT及AST指标的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，测试方法参考试剂盒说明书。

1.2.6 数据统计分析

实验数据重复3次，使用DPS统计软件，LSD法对数据进行分析，以ANOVA(P<0.05)为差异具有统计学意义，使用Origin8软件绘制统计图。

2 结果与分析

2.1 螺旋藻多糖对急性酒精中毒小鼠肝、心、肾及胸腺中CAT含量的影响

CAT可以使过氧化氢还原成水和分子氧，清除体内的过氧化氢，避免细胞受损，而活性氧浓度大于一定量时，酶的作用就会减弱。如图1所示，模型组小鼠肾脏、心脏、胸腺、肝脏的CAT活力明显低于空白对照组(10%～20%)，且显著差异(P<0.05)，说明造模成功。阳性对照组的CAT含量升高，均达到空白组水平，且差异不显著，说明给药成功。在肾脏组织中，多糖组能够显著提高CAT活力，可达到阳性对照组水平，且与多糖剂量呈现非浓度依赖性，在心脏、胸腺、肝脏组中能够一定程度恢复CAT活力，但达不到阳性对照组水平(70%、65%和80%)，且与多糖剂量呈现浓度正相关。其中高剂量螺旋藻多糖组小鼠的各组织CAT水平均达到空白组的90%，几乎接近阳性对照组水平，且差异不显著。低剂量螺旋藻多糖组小鼠的各组织中CAT含量也达到空白组水平的75%左右。以上结果说明螺旋藻多糖有效提高急性酒精性肝损伤小鼠肾脏、心脏及肝损伤的CAT活性，增强了小鼠机体的抗氧化能力。

A：肾脏；B：心脏；C：胸腺；D：肝脏

图1螺旋藻多糖对小鼠肾脏、心脏、胸腺及肝脏CAT含量的影响的含量

Figure 1 Effect of PSP on CAT contents in kidney， heart， thymus and liver of mice (x±s,n=6)

2.2 螺旋藻多糖对急性酒精中毒小鼠肝、心、肾及胸腺中GSH含量的影响

GSH 是一种小分子肽，具有抗氧化的功能从而可以清除自由基。如图2所示,模型组小鼠各组织的GSH含量明显低于空白对照组，说明急性酒精灌胃(12 mg/kg)会降低肾脏、心脏、胸腺和肝脏中GSH的含量，且差异显著(P<0.05)，说明造模成功。阳性对照组的GSH含量升高，均达到空白组水平，且差异不显著，说明给药成功。高剂量多糖组能够提高肾脏、心脏、肝脏组织中GSH活力，达到空白组水平，且差异不显著;在胸腺组织中，高剂量多糖组未达空白组水平，差异显著(P<0.05)。低剂量多糖组达到阳性对照水平的40%～60%，远低于空白组水平且差异显著(P<0.05)。实验结果说明螺旋藻多糖可显著提高急性酒精性小鼠肾脏、心脏、胸腺及肝脏的GSH含量，提高机体的抗氧化能力，对急性酒精性中毒起到显著的保护作用。

A：肾脏；B：心脏；C：胸腺；D：肝脏

图2螺旋藻多糖对小鼠肾脏、心脏、胸腺及肝脏GSH含量的影响

Figure 2 Effect of PSP on GSH contents in kidney, heart,
thymus and liver of mice (x±s,n= 6)

2.3 螺旋藻多糖对急性酒精中毒小鼠肝、心、肾及胸腺中MDA含量的影响

MDA 是脂质过氧化最重要的产物之一，反映膜的损伤程度，其在组织的含量与细胞损伤程度成正相关，所以在机体衰老抗性生理研究中，MDA是评价细胞膜过氧化程度的重要指标。由图3可见，模型组小鼠肾脏、心脏、胸腺及肝脏的MDA含量平均是空白对照组的3倍，说明造模成功；与模型组相比，阳性对照组中各组织的MDA含量降低至正常水平，且差异不显著，说明给药成功。在肾脏、心脏、胸腺和肝脏组织中，低剂量多糖组能够一定程度恢复MDA活力，但无法达到阳性对照组水平。高剂量多糖组清除MDA效果优于低剂量多糖组，且治疗效果在肝脏中最接近阳性对照水平且差异不显著。以上结果说明螺旋藻多糖能有效改善急性酒精对小鼠肾脏、心脏、胸腺及肝脏氧化损伤的保护能力。

2.4 螺旋藻多糖对急性酒精中毒小鼠肝ATL和AST含量的影响

ALT和AST是存在于肝细胞内的代谢酶类，在肝损伤的情况下ALT和AST的含量会上升，所以常用ATL和AST作为急性肝细胞损害的敏感标志，同时也是临床肝功能检验的常用指标。如图4所示，模型组小鼠肝脏的ALT和AST含量明显高于空白组，且差异显著(P<0.05)，说明造模成功；阳性对照组的ALT和AST含量接近空白组，说明给药成功。低剂量多糖组中，小鼠肝脏中的ALT和AST含量均有不同程度下降，高剂量螺旋藻多糖中ALT和AST均降低至阳性对照水平，差异不显著，且治疗效果与多糖剂量呈现浓度正相关。说明螺旋藻多糖能够提高急性酒精引起损伤的抗氧化水平，对酒精性肝脏损伤具有一定的保护作用。

A：肾脏；B：心脏；C：胸腺；D：肝脏

图3螺旋藻多糖对小鼠肾脏、心脏、胸腺及肝脏MDA含量的影响的含量

Figure 3 Effect of PSP on MDA contents in kidney， heart， thymus and liver of mice (x±s,n= 6)

A：ATL； B：AST

图4PSP对小鼠肝脏ALT和AST含量的影响

Figure 4 Effect of PSP on ALT and AST contents in liver of mice (x±s,n= 6)

3 讨论与结论

饮酒过量会引起机体组织的急性和慢性酒精中毒，短时间内摄入过多的乙醇，在体内代谢过程中会产生氧化应激作用[18-21]，机体组织会释放大量的活性自由基，这些自由基可以促使膜氧化、加速细胞的衰老和解体，从而使细胞的正常功能受损，丧失正常功能，造成机体代谢紊乱[22-24]。

本实验通过使用钝顶螺旋藻多糖建立急性酒精组织损伤模型，测定各组中小鼠组织中MDA、GSH、CAT以及肝脏中ALT和AST的含量变化，探讨螺旋藻多糖对急性酒精性中毒引起的肝脏、肾脏、心脏、胸腺的损伤的保护作用。结果显示,造模后小鼠各组织中MDA含量明显高于空白对照组，心脏、肝脏、肾脏及胸腺组织中CAT 、GSH的活性均明显低于空白对照组。其机制可能是乙醇引起小鼠体内自由基含量增多，进而引起生物膜受损、MDA含量增加，同时消耗体内大量CAT和GSH以抵御自由基引起的损伤，使其活力下降，导致机体防御系统平衡失调，引起器官细胞发生脂质过氧化，增强细胞膜通透性，膜表面受体受损，进而影响机体的免疫功能，与急性酒精损伤机理的结果相同。摄入螺旋藻多糖的小鼠,多糖高剂量组肾脏 MDA 含量在P<0.05水平上有显著性恢复，接近空白对照组水平，而在肝脏、心脏、胸腺中显著性较低，这可能是因为4种器官不同功能所造成的，胸腺自身的免疫功能可以减少酒精带来的伤害；在多糖高剂量组的肾脏中CAT和GSH 活性接近空白水平，且显著性差异明显高于心脏、肝脏、胸腺。而心脏、肝脏、胸腺匀浆三者的 CAT和GSH 活性虽低于肾脏组织，但随着多糖剂量的上升， CAT和GSH的活性逐渐上升,呈一定的量效关系，这可能是螺旋藻多糖提高内源性抗氧化防御体系实现的。已有研究表明，枸杞多糖与黄芪多糖[25]联用可以有效清除MDA含量及促进GSH含量升高；黑牛肝菌多糖[26]可以降低MDA含量，提高SOD抗氧化水平；植物多糖[27]通过提高细胞内SOD、CAT、GSH 等抗氧化物水平及清除积累的MDA，可以提高细胞的抗氧化活性，降低细胞的氧化损伤程度，铁皮枫斗多糖[28]能够显著降低血清中AST和ALT活性，减少肝脏功能损伤。与上述多糖结果相似，本实验结果显示模型组中AST和ALT含量2倍于空白组，螺旋藻多糖组中AST和ALT活性下降接近空白组水平，呈一定的量效关系，且差异不显著。螺旋藻多糖对预防急性酒精中毒引起的肝脏、肾脏、心脏、胸腺的损伤具有明显的保护作用。相较人工合成的药物，螺旋藻多糖作为天然的抗氧化剂，几乎不会对机体产生副作用，有望开发为绿色的保健食品。