乳腺癌MDA-MB-231细胞中Rab7a基因的网络分析

徐凤英， 刘 儒， 马 丽， 曲一帆， 肖伟利， 王玉珍，谢基明

( 1.内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古 呼和浩特 010110；2.内蒙古自治区人民医院检验科，内蒙古 呼和浩特 010010；3.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

Rab7a基因和Rab7b基因是Rab7基因家族的2个同源亚型，具有较高的序列相似性[1]。与负责从核内体向高尔基体转运的Rab7b不同[2]，Rab7a位于晚期核内体，控制向内吞降解室的转运[3]。Rab7a是溶酶体、吞噬体和自噬体成熟所必需的，并已被证明可调节细胞的存活和凋亡。最近报道[4]表明：Rab7a在癌症中也发挥了重要作用。波形丝蛋白是反映上皮间质转化的一个指标[5]，在癌细胞中由Rab7a调控[6]。伏立诺和辛伐他汀可通过抑制Rab7协同抑制三阴性乳腺癌(tripe-negative breast cancer,TNBC)的发展[7]。然而目前尚未见关于Rab7a相关联基因如何参与TNBC发生发展的报道。本研究利用慢病毒载体敲除TNBC MDA-MB-231细胞中Rab7a基因，通过与阴性对照组比较，对差异基因进行分析，推断Rab7a及其关联基因的相互作用以及其可能参与的重要病理过程。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒、主要试剂和仪器人乳腺癌ZR-75-30、T-47D、HCC-1937、MDA-MB-231和MCF-7细胞购自美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)。慢病毒lv-Rab7a-sgRNA和阴性对照CON251购自上海吉凯基因化学技术有限公司。DMEM培养基购自美国Invitrogen公司，Ausbian胎牛血清(FBS)购自上海威正翔禹生物科技有限公司，BCA试剂盒和RIPA裂解液均购自上海碧云天生物有限公司。 anti-Rab7a和anti-GAPDH均购自美国Santa Cruz公司，TRIzol试剂盒购自上海普飞公司，M-MLV反转录试剂盒、dNTP和Rnase Inhibitor均购自北京Promega公司，SYBR Master Mixture购自日本TaKaRa公司，人基因表达谱芯片(货号:901838)、安捷伦RNA 6000 Nano 试剂盒、3′IVT PLUS基因芯片和基因芯片杂交洗涤染色试剂盒均购自美国Affymetrix公司。

1.2 细胞培养人乳腺癌ZR-75-30、T-47D和HCC-1937 细胞置于RPMI1640培养基中培养，乳腺癌MCF-7细胞采用DMEM培养基培养，MDA-MB-231细胞采用L-15培养基培养。培养基中血清含量均为10%。MDA-MB-231 细胞隔天换液1次，当细胞生长至80%～90% 融合时，采用含 EDTA 的 PBS 平衡盐溶液漂洗，再采用0.25%胰蛋白酶消化传代，均在37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3 Western blotting法检测乳腺癌ZR-75-30、MCF-7、T-47D、MDA-MB-231和HCC-1937细胞中Rab7a蛋白表达水平收集对数生长期目的细胞，提取总蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白水平。取50 μg蛋白样品按比例加入上样缓冲液，沸水浴5 min，冷却离心后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，采用湿转法120 V、90 min将蛋白质电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后采用磷酸盐缓冲液和吐温20 (TBST)溶解的5%脱脂奶粉室温封闭4 h，阻断与抗体的非特异性结合。膜与一抗(1∶1 000) 4℃孵育过夜，次日采用TBST洗涤3次(每次10 min)，室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000) 2 h，TBST洗涤3次(每次10 min)后检测PVDF膜上Rab7a蛋白表达水平。

1.4 慢病毒载体介导的Rab7a基因敲除将处于对数生长期的MDA-MB-231 细胞经胰酶消化，完全培养基制成细胞密度为(3～5)×104mL-1的细胞悬液，取2 mL接种于 6孔板 ，培养24 h后，采用感染复数(MOI)为10的慢病毒感染MDA-MB-231细胞以敲除Rab7a基因，培养12 h后采用完全培养液代替病毒感染液继续培养。慢病毒载体上的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达率为90%时，收集细胞进行后续Rab7a基因敲除效率的验证。Rab7a基因敲除组根据敲除的4种不同Rab7a基因序列分为KD1组、KD2组、KD3组和KD4组，并设置阴性对照组。各组Rab7a基因敲除序列见表1。

表1 各组Rab7a基因敲除序列

1.5 qPCR法检测各组乳腺癌MDA-MB-231细胞中Rab7a基因敲除效率采用TRIzol试剂盒对病毒感染的各组乳腺癌MDA-MB-231细胞进行裂解和总RNA提取。取2 μg总RNA和2 μL反转录引物，根据 M-MLV试剂盒说明进行反转录合成cDNA，采用qPCR法扩增目的基因和内参基因。Rab7a基因敲除效率为Rab7a mRNA表达水平降低百分比，Rab7a mRNA表达水平以每组测得的目的基因Rab7a和内参基因GAPDH的CT值并采用2-ΔΔCt法进行计算。ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值，ΔΔCt=阴性对照组ΔCt平均值-各样品ΔCt值。Rab7a基因引物序列见表2。

表2 Rab7a基因和内参基因引物序列

Tab.2 Primer sequences of Rab7a gene and internal reference gene

GeneSequence (5'-3')Rab7a senceGTCGGGAAGACATCACTCARab7a antisenceCTAGCCTGTCATCCACCATGAPDH senceTGACTTCAACAGCGACACCCAGAPDH antisenceCACCCTGTTGCTGTAGCCAAA

1.6 芯片实验采用TRIzol法抽提阴性对照组和KD2组样品总RNA，抽提所得总RNA经NanoDrop 2000和Agilent Bioanalyzer 2100质检，合格样本进入芯片实验。芯片实验的步骤主要包括样品的制备、芯片杂交、芯片洗染、芯片扫描和结果分析。

1.7 Rab7a基因敲除后一体化通路分析(IPA)IPA是一个一体化在线整合分析软件(www.ingenuity.com)[8]，用于基因、microRNA数据和小规模实验数据的分析。IPA建立了可视化的实验系统，用于理解基因、蛋白质、化学物质和药物等属性，同时可呈现分子之间相互作用的关系网。IPA使用网络生成算法，按照本课题组预设的网络大小将分子之间的网络图分割成多个网络，并给每一个网络进行打分。Score基于P值计算，反映了网络中的数据集分子出现在该网络中为随机过程的概率。Score打分是基于超几何分布，通过右尾的Fisher精确检验获得显著性水平的负对数值。所有的网络使用Score值进行排序。Score值大于2代表该功能被显著激活，Score值小于-2代表该功能被显著抑制。

2 结 果

2.1 各组乳腺癌细胞中Rab7a蛋白表达以表达Rab7a的293T细胞作为阳性对照，收集对数生长期乳腺癌ZR-75-30、MCF-7、T-47D、MDA-MB-231和HCC-1937细胞总蛋白，Western blotting法分析结果显示：与阳性对照组比较，乳腺癌ZR-75-30、T-47D、MDA-MB-231和HCC-1937细胞中均可见Rab7a蛋白表达。见图1。

Lane 1： Positive control group(293T cells);Lane 2：ZR-75-30 cells；Lane 3：MCF-7 cells；Lane 4：T-47D cells；Lane 5：MDA-MB-231 cells；Lane 6：HCC-1937 cells.

图1 各组乳腺癌细胞中Rab7a蛋白表达电泳图

Fig.1 Electrophoregram of expressions of Rab7a protein in breast cancer cells in various groups

2.2 慢病毒感染MDA-MB-231细胞中荧光表达MDA-MB-231细胞感染慢病毒96 h后，阴性对照组和KD1、KD2、KD3及KD4组细胞生长状态良好，病毒感染率达到90%以上。见图2(插页三)。

2.3 各组MDA-MB-231细胞中Rab7a基因敲除效率与阴性对照组比较， KD1组MDA-MB-231细胞中Rab7a mRNA表达水平下调了76.2%，即Rab7a基因敲除效率为76.2%；KD2组MDA-MB-231细胞中Rab7a mRNA表达水平下调了87.9%，KD3组MDA-MB-231细胞中Rab7a mRNA表达水平下调了86.2%，KD4组MDA-MB-231细胞中Rab7a mRNA表达水平下调了58.2%；与其他各组比较，KD2组细胞的靶序列具有最高的敲除效率(P<0.001)，即KD2组细胞的靶序列是敲除效率最高的靶点。见图3。

*P<0.01 vs negative control group.

Fig.3 Expression levels of Rab7a mRNA in MDA-MB-231 cells in various groups

2.4 Rab7a基因敲除后的显著性差异基因分布对Rab7a敲除效率最高的KD2组与阴性对照组进行基因芯片检测结果显示:与阴性对照组比较，KD2组检测的上调基因数(262个)增多(P<0.01)，下调基因数(372个)增多(P<0.01)。火山图展示了与阴性对照组和KD2组差异基因分布情况。横坐标代表经过以2为底对数转换的差异倍数，纵坐标代表经过以10为底对数转换的矫正显著性水平；红色表示差异倍数大于1.5、显著性水平小于0.05的所有探针。横坐标0左侧代表下调的基因数，右侧代表上调的基因数。见图4(插页三)。

2.5 差异基因相关疾病与功能关系对这634个差异基因进行疾病与功能的IPA，疾病与功能柱状图展示差异基因在疾病与功能分类中的富集情况。所有疾病与功能使用-Log(Pvalue)值由高到底排序(即按照P值由小到大排序)。与阴性对照组比较，KD2组中与Rab7a相关联的基因主要与癌症、机体损伤和异常及细胞存活等有密切关联。见图5。

1:Cancer;2:Organismal injuries and abomalities;3:Cell death and survival;4:Cell growth;5:Protein synthesis;6:Cell-to-cell signaling and interaction;7:Cellular movement;8:Cellular development;9:Tumor morphology;10:Organismal survival;11:Gastrointestinal disease;12:Hematological system development and function;13:Immune cell trafficking;14:Hematological disease;15:Immunological disease.

图5 差异基因相关疾病与功能关系的直条图

Fig.5 Histogram of disease and function associated with different genes

2.6 指定基因IPA网络图根据指定基因VEGFA、IRS1、RPS6KB1、EIF4E和PRKAA1，添加目的基因Rab7a，通过IPA分析平台绘制基因关系网络图。在网络图中，Rab7a基因敲除导致eIF4F和IRS1表达下调以及激酶RPS6KB1表达下调；激酶PRKAA1和IKBKE表达上调及VEGFA和转录因子ATF2表达上调。见图6。

3 讨 论

图6 指定基因的IPA网络图

乳腺癌已成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤[9]，且死亡率持续升高[10],其中TNBC占浸润性乳腺癌的10%～20%，严重影响女性健康与生活质量[11]。由于TNBC不表达雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)，因此内分泌治疗及抗HER2分子靶向治疗对TNBC患者无效[12]。目前有效的全身治疗方法是具有细胞毒性的化疗，这种治疗方式不良反应大且耐药性高[13]。因此，探索TNBC发生变化的分子机制可能有助于深入了解这种疾病的治疗策略[14]。

本课题组前期的研究[4]已经证实：Rab7a在乳腺癌中发挥致癌基因的作用,促进乳腺癌的生长和侵袭。本研究中采用重组的4 种不同靶序列的慢病毒敲除MDA-MB-231细胞的Rab7a基因，并成功获得持久基因沉默、稳定低表达Rab7a的MDA-MB-231 细胞。通过对不同靶点敲除效率的验证，筛选出Rab7a敲除效率最高的KD2组进行基因芯片分析，结果显示：与Rab7a敲除相关联的基因有262个上调基因，372个下调基因。对差异基因进行IPA分析可见Rab7a及其相关联基因与癌症、细胞存活、机体损伤和异常、炎症、免疫反应等有密切联系，提示Rab7a及相关基因参与多种病理过程[15-18]。在指定的基因列表中，本研究通过添加目的基因Rab7a进行IPA分析，在基因网络分析图中，Rab7a与指定各基因相互作用并发生变化。真核起始因子(eIFs)在肿瘤发生发展起重要作用，mTOR/eIF4F轴有助于乳腺癌的维持和进展[19]。本研究中，eIF4F被Rab7a敲除后表达下调，提示Rab7a可能通过调节eIF4F而促进乳腺癌发生。此外，Rab7a沉默还导致RPS6KB1表达降低，有研究[20]显示：RPS6KB1在乳腺癌组织中发生了改变。本研究结果显示：Rab7a耗竭增强了PRKAA1的表达。目前PRKAA1在癌症发展中的作用尚不明确，PRKAA1和RPS6KB1在乳腺癌发展中的作用需要进一步研究。

综上所述，可将TNBC细胞中Rab7a作为一个靶基因，对其相关联基因进行IPA分析，全面预测Rab7a可能参与的疾病进程，并将Rab7a与其相关基因进行相互关联分析，为将来更深层次的研究奠定基础。