胸腔积液中B7-H4蛋白联合ADA和CEA水平检测在胸腔积液鉴别诊断中的应用价值

李锐成，郜赵伟，张惠中，林 芳，刘 冲，董 轲

(中国人民解放军空军军医大学第二附属医院唐都医院检验科，陕西 西安 710038)

研究[1]显示：可导致胸腔积液(pleural effusion，PE)的疾病有上百种，恶性PE多由恶性肿瘤(淋巴瘤、胃肠道肿瘤、卵巢肿瘤、乳腺肿瘤和肺部肿瘤等)转移至胸膜，良性PE多继发于各类炎症(结核性胸膜炎、肺炎、结缔组织病、器官功能障碍和系统性疾病等)[2-3]。多项研究[4-7]显示：肺癌性恶性胸腔积液(malignant pleural effusion associated with lung cancer，LC-MPE)和结核性胸腔积液(tuberculous pleural effusion，TPE)是渗出性PE产生的2种最常见原因，并且二者的临床表征、影像学和实验室检查结果相似。LC-MPE所引起的喘息、憋闷和呼吸困难等临床症状严重影响患者的生存质量、预后和生存期[8]。TPE是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)侵及胸膜后导致结核性胸膜炎产生的变态反应所致，如能早诊断早治疗，则患者预后较好[9]。LC-MPE和TPE的致病机制、治疗方案和预后转归不同，提示早期诊断十分重要。

多项研究[10-13]显示：负性共刺激因子B7-H4过表达与肿瘤的发生、侵袭、发展、转移和严重程度密切相关。可溶性B7-H4水平可以作为肿瘤侵袭深度、肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤阶段和预期寿命的预测指标。研究[14]表明：实体肿瘤患者血清中也能检测到B7-H4水平异常升高，表明B7-H4可作为恶性肿瘤的诊断、治疗监测和预后判断的分子生物学标志物，但有关于B7-H4蛋白在LC-MPE和TPE中表达水平的关系却尚未见报道，本研究探讨了单项和联合PE中腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)和B7-H4蛋白检测在诊断LC-MPE与TPE中的价值及其鉴别阈值，为2种疾病的鉴别诊断及早期诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

研究对象来源于2017年9月—2018年12月本院胸腔外科和呼吸科就诊的PE待查患者202例,其中LC-MPE组120例(包括肺腺癌79例、肺鳞状细胞癌20例和肺小细胞癌21例)，其中53例患者通过胸膜活检确诊，67例患者通过胸水病理细胞学确诊；TPE组82例，10例患者通过胸水病理细胞学确诊，52例患者在胸膜活检中显示典型的上皮样细胞干酪性肉芽肿，其余20例患者根据试验性用药确诊。本研究拟定试验方案后，经本院医学伦理委员会批准，并获得了受试者知情同意。

1.2 诊断、纳入和排除标准

1.2.1 诊断标准 LC-MPE诊断：需满足以下所有标准：① X线或CT检查有肺部肿块、阴影，抗结核治疗无效或加重；② PE为渗出性，抗酸染色结果阴性或MTB培养阴性；③ 组织病理学检查证实为肺癌[15]。

TPE诊断：需至少满足以下1条标准：① PE为渗出性，PE抗酸染色结果阳性或MTB培养阳性；② 胸膜组织病理学检查证实结核，如可见郎罕氏巨细胞、干酪样坏死和典型的增殖样结核改变等；③ 患者临床表现有明显的结核中毒症状(低热、盗汗和乏力等)，并有一般胸膜炎症状(咳嗽、胸闷和胸痛等)，抗结核治疗PE明显吸收[16]。

1.2.2 纳入标准 ① PE初诊患者且尚未采取任何有针对性的抗结核和抗肿瘤治疗；② 年龄大于40岁；③ 肝、肾和心功能无明显异常；④ 未并发其他部位肿瘤；⑤ 临床资料完整，出院最终诊断明确；⑥ PE标本新鲜，足量，抽取后立即送检。

1.2.3 排除标准 ① 入院前有手术和放化疗史者；② 受试者标本量不足1 mL者；③ 有严重心、肝和肾脏功能不全者；④ 妊娠者；⑤ 临床资料不完善者；⑥ 标本存在明显溶血、严重脂血者；⑦诊断不清或尚未明确者；⑧ 免疫缺陷者。

1.3 标本收集和检测方法

1.3.1 标本收集方法 收取PE待查患者穿刺液样本1～5 mL，首先用200目无菌滤网去除PE中的凝块和絮状沉淀等有形成分后采用15 mL离心管3 000 r·min-1离心10 min，再用加样枪吸取1 mL上清置于一次性1.5 mL离心管中，于管盖上做好标记，置于-80℃冰箱保存，后依据明确的诊断和纳入标准，筛选出符合要求的PE标本待测B7-H4蛋白。

1.3.2 标本检测 相对应的PE中ADA和CEA检测分别由本院检验科生化室和免疫室完成，采用酶速率法检测ADA水平，仪器为美国贝克曼COULTER-AU5800全自动生化分析仪，试剂为科华生物科技股份有限公司生产，结果以U·L-1表示；采用电化学发光法检测CEA水平，仪器为德国罗氏E-601型电化学发光自动分析仪，试剂为德国罗氏配套产品，结果以 μg·L-1表示；采用双抗体夹心ELISA法检测B7-H4蛋白水平，试剂为英国Abcam公司生产的Human B7-H4 SimpleStep ELISA Kit试剂盒，结果以ng·L-1表示。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 2组PE患者基本资料

202例患者中，男性135例，女性67例，平均年龄为(61.84±11.85)岁；LC-MPE组患者120例，男性80例，女性40例，平均年龄(61.75±10.85)岁；TPE组患者82例，男性55例，女性27例，平均年龄(61.94±13.25)岁。2组患者性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组PE患者基本资料

“-”：No data.

2.2 2组患者PE中ADA、CEA和B7-H4蛋白水平

TPE组患者的ADA水平明显高于LC-MPE组(P<0.05)； LC-MPE组患者CEA和B7-H4蛋白水平高于TPE组(P<0.05)。见表2。

2.3 ADA、CEA和B7-H4蛋白各单项指标及联合诊断对LC-MPE和TPE的鉴别诊断价值

采用ROC曲线分析ADA、CEA和B7-H4蛋白各单项指标及联合诊断：① ADA、CEA和B7-H4蛋白的最佳临界值分别为15.50 U·L-1、3.26 μg·L-1和24.38 ng·L-1，相应的灵敏度分别为93.30%、83.33%和79.90%，特异度分别为86.59%、96.34%和72.50%，AUC分别为0.927(95%CI：0.885～0.969)、0.925(95%CI：0.889～0.962)及0.836(95%CI：0.782～0.890)；② 各单项指标YI均大于0.5(YI分别为0.800、0.800和0.518)，且ADA和CEA 的YI均大于0.7；③ 各单项指标AUC均大于0.7(0.927、0.925 和0.836)；④ 各单项指标均同时具备了YI大于0.5且AUC大于0.7的条件，具有较好的鉴别诊断价值，其中ADA的灵敏度最高(93.30%)，CEA特异度最高(96.34%)，B7-H4蛋白的诊断效能最低(灵敏度为79.90%，特异度为72.50%，YI为0.518，AUC为0.836)；⑤3项指标进行联合鉴别诊断后，CEA+B7-H4蛋白模式有最高的灵敏度(100.00%)，ADA+CEA模式有最高的特异度(98.33%)，ADA+CEA+B7-H4蛋白模式有最高的诊断效能(灵敏度为93.90%，特异度为97.50%，YI为0.914，AUC为0.989)。见表3和图1。

表2 2组患者PE中ADA、CEA和B7-H4水平

表3 ADA、CEA和B7-H4单项和三者联合诊断LC-MPE和TPE的价值

“-”：No data.

图1 ADA、CEA和B7-H4单项和三者联合诊断LC-MPE和TPE的ROC曲线

Fig.1 ROC curves of single and combined detection of ADA,CEA,and B7-H4 for differential diagnosis of LC-MPE and TPE

3 讨 论

ADA广泛存在于淋巴组织丰富的器官，主要参与嘌呤核苷酸代谢，而作为重要免疫抑制因子的腺苷又是该代谢过程的中间产物[17]。因此，ADA可通过调节腺苷的方式在机体正常免疫系统的平衡稳态中发挥重要作用[18]。ADA与机体的免疫调节有关联，因而其活性检测已经广泛应用到多种疾病的辅助诊断，如结核病、肝病甚至自身免疫性疾病[19]。发生结核性胸膜炎时，因以淋巴细胞活性升高为主的细胞免疫机制被启动导致淋巴细胞活性普遍升高[20]。ADA主要存在于淋巴细胞中且与机体免疫调节有密切关联[21-22]。本研究中LC-MPE患者PE中ADA水平低于TPE组，ROC曲线分析显示：15.50 U·L-1为最佳临界值，灵敏度、特异度、YI和AUC分别为93.30%、86.59%、0.800和0.927，显示出极好的诊断效能，与ZHANG 等[23]报道结果相符。

作为一种肿瘤相关抗原，CEA用于多种恶性肿瘤的筛查和诊断。当肿瘤侵及胸膜时，肿瘤细胞会大量分泌CEA并释放入PE，因其为结构复杂的酸性糖蛋白，相对分子质量较大，极难由PE入血，更不似血液中的CEA可经血液循环系统进入肝脏代谢降解，致使恶性PE中CEA水平远高于血清[24]。但因恶性PE产生复杂，起因于多种肿瘤，且以肺癌为著，肺癌有多种病理类型，导致国内外PE中CEA标准尚无统一参考值范围[25]。本研究结果显示TPE组患者PE中CEA水平明显低于LC-MPE组，CEA的最佳临界值为3.26 μg·L-1，灵敏度、特异度、YI和AUC分别为83.33%、96.34%、0.800和0.925，显示出极好的诊断效能。因本研究旨在探讨LC-MPE与TPE之间的鉴别诊断而仅选择TPE作为对照组，与多数研究以肺部良性疾病(肺炎和结核性胸膜炎等)为对照组不同，因此对照组选择的不同导致结果与RADJENOVIC等[26]和SON等[27]的报道结果略有差异。

负性共刺激因子B7-H4属于B7家族成员，研究[28]表明：B7-H4蛋白在某些恶性肿瘤中出现过度表达，并且与肿瘤的侵袭、转移、逃逸和预后密切相关，如乳腺癌、肾细胞癌及卵巢癌等[29]。那么肿瘤患者体液标本中B7-H4水平是否也出现异常升高？TPE患者体液标本中B7-H4蛋白水平如何？针对LC-MPE和TPE在临床诊断中的难以鉴别这一难题，检测PE中的B7-H4蛋白水平是否有助于二者的鉴别诊断？基于上述文献报道和临床实际，本研究检测2组患者PE中B7-H4蛋白水平，结果显示：TPE组患者PE中B7-H4蛋白水平低于LC-MPE组。本研究中其最佳诊临界为24.38 ng·L-1，灵敏度、特异度、YI和AUC分别为79.90%、72.50%、0.518和0.836，显示出较好的诊断效能。因此PE中B7-H4蛋白水平检测可作为LC-MPE和TPE患者的鉴别诊断指标。

近年来，多项指标联合检测对PE性质进行鉴定的研究[30]多有报道，但将LC-MPE从MPE中独立出来利用PE中B7-H4蛋白水平与TPE进行鉴别诊断却未见报道。本研究利用ROC曲线对ADA、CEA和B7-H4蛋白的单项诊断效能进行初步评价(YI均>0.5，AUC均>0.7)，之后对此3项指标进行多指标联合探讨其在LC-MPE和TPE的鉴别诊断方面的价值。本研究采用平行试验，纳入4种联合模式，ADA+CEA联合模式诊断效能最高。3项同时联合模式拥有4种联合模式中最高的诊断效能。从单项指标、2项联合以至3项联合纳入指标逐次递增的同时，诊断性能也在随之增高，且3项指标同时联合检测的诊断效能最高。

综上所述，在鉴别诊断LC-MPE和TPE时，联合诊断的诊断效能高于单项指标，应尽量进行多指标联合诊断；ADA+CEA+B7-H4蛋白3项指标联合模式明显提高了诊断效能，可作为一项理想的诊断模式，对有效鉴别LC-MPE和TPE、减少误诊漏诊具有重要的临床意义(尤其是在病理手段未能明确病因的情况下)。由于肺癌导致的PE以腺癌居多，导致本研究纳入的鳞癌和小细胞癌的样本量较少，存在病理分型引起的偏倚，未来本课题组将增加样本量，纳入更多肺鳞癌和小细胞癌病例，进一步探讨B7-H4蛋白在肺癌的治疗监测及预后评估中的临床应用价值。