长链非编码RNA RP1-85F18.6在乳腺癌细胞中的表达及其对增殖和细胞周期的影响

程虎，刘名奎

（武汉科技大学附属武昌医院 普通外科，湖北 武汉430063）

乳腺癌是全球范围内女性常见的恶性肿瘤[1-2]。 据2018年全球癌症数据统计显示，乳腺癌新发 210万例，占全年所有新发肿瘤例数的11.6%，新发死亡例数63万，占全球肿瘤死亡例数的6.6%。乳腺癌占860万女性癌症新发病例的24.2%，420万女性癌症死亡病例的15.0%，均居首位[3]。在我国，情况亦不容乐观，据最新统计数据显示2014年中国女性乳腺癌发病率为每10万例28.77，病死率为6.35每10万例，发病率居女性首位，病死率居第2位[4]。随着手术、新辅助化疗及分子靶向治疗的进步，早期乳腺癌预后有了很大程度的改善[5-6]，但乳腺癌晚期预后仍不佳，深入研究乳腺癌的发病机制对提高乳腺癌的诊治水平具有重要意义。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度为200 nt的不具有编码功能的RNA分子[7]，广泛调控组织分化、细胞增殖、胚胎发育等过程[8]，参与调控多种肿瘤增殖、凋 亡、侵袭及转移等过程[9-10]。lncRNA RP1-85F18.6是个新发现的分子，基因定位于人类22号染色体上[11]。在结直肠癌中首先报道，其在结肠癌组织和细胞系中高表达，并可促进肿瘤细胞增殖和侵袭，抑制凋亡及调控细胞周期[12]。然而，目前尚无文献报道lncRNA RP1-85F18.6在乳腺癌细胞系中的表达及功能。本研究旨在研究lncRNA RP1-85F18.6在乳腺癌细胞系中的表达，及其对细胞增殖和细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A及乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MBA-MD-468、MCF-7均购自美国ATCC公司。检测所需的Ki-67、增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）、细胞周期蛋白A1（cyclin A1）、p21C1P1和GAPDH一抗及羊抗兔二抗购自美国Abcam公司。DMEM细胞培养基购自Gibco公司，Lipofectamine™ 3000 Transfection Reagent购自Thermo Fisher公司，RP1-85F18.6沉默序列（RP1-85F18.6-siRNA）与阴性对照序列均由上海吉玛生物科技公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及转录实验所需的细胞系均在 37 ℃、5%CO2条件下培养于无菌细胞培养箱中，所有细胞均使用含有10%FBS的D-MEM细胞培养基，每3天消化传代1次。RP1-85F18.6-siRNA与阴性对照序列均稀释至终浓度60 nmol/L用于转染，MDA-MB-231细胞系经培养后取对数期细胞分成 3组，沉默组、阴性对照组及空白对照组，根据试剂盒说明书在37 ℃条件下使用LipofectamineTM3000（Thermo Fisher Scientific公司，美国）分别转染RP1-85F18.6-siRNA序列、阴性对照序列及空白对照。转染所用siRNA序列如下：RP1-85F18.6 siRNA，5'-GAC TCC GCC GTG AAC CCT TCA-3'，scramble siRNA（siN05815122147）为阴性对照siRNA序列。

1.2.2 qRT-PCR使用RNeasy Mini Kit试剂盒（北京碧云天生物公司）提取各组细胞总miRNA，使用qRT-PCR仪检测各组样品表达量，以GAPDH为内参。PCR引物序列如下：lncRNA RP1-85F18.6正向：GGC TCT TTG CTC ACA TCG，逆向：AAG GAA ACC ACA GGC TCA；GAPDH正向：ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC，逆 向：TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA。反应条件为95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s共35循环，获取各组样品CT值，采用2-ΔΔCT计算法计算lncRNA RP1-85F18.6的相对表达量。

1.2.3 细胞增殖能力测定使用MTT 法测定 沉默组、阴性对照组及空白对照组3组细胞增殖能力，使用96 孔板培养细胞，细胞数目为2×103个/孔，0、24、48、72、96 h后分别加入10 µL MTT溶液，用DNM-9606酶标仪检测各组的OD490nm，以OD490nm为纵坐标，转染时间为横坐标，绘制细胞增殖曲线。

1.2.4 流式细胞仪测定细胞周期采用PI染色法测定细胞周期，将沉默组、阴性对照组及空白对照组取转染培养后对数生长期细胞，以800 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤2次，加入预冷75%乙醇，于4 ℃固定4 h以上。1 500 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤，加入400 L的PI染液和100 L RNase A（100 µg/mL），于4 ℃避光孵育30 min。上机，按照标准程序用流式细胞仪检测各组细胞周期，结果用细胞周期拟合软件ModFit进行分析，实验重复3次，取平 均值。

1.2.5 Western blot测定增殖及细胞周期蛋白表达将沉默组、阴性对照组及空白对照组细胞培养24 h后，裂解提取各组细胞总蛋白，BCA法测定总蛋白含量。Western blot电泳条件：浓缩胶80 V 60 min，分离胶100 V 90 min，使用半干法转膜，一抗（1:200）于4 ℃孵育过夜，二抗（1:500）于37 ℃孵育2 h，PBS漂洗，ECL发光液显影后使用胶片曝光，扫描仪导入胶片图片后使用Image J软件分析蛋白灰度值，实验重复3次，取平均值。

1.3 统计学处理

统计分析采用SPSS 20.0版本分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间的数据比较采用t检验，3组间的比较采用方差分析，在有意义的基础上再采用LSD-t检验行两组间的比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 lncRNA RP1-85F18.6在乳腺癌细胞系及正常乳腺癌细胞系中的表达

qRT-PCR示，正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中lncRNA RP1-85F18.6相对表达量为1.03±0.04，乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MBAMD-468及MCF-7中lncRNA RP1-85F18.6相对表达量分别为2.58±0.81、3.33±0.53、3.34±0.76，乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MBA-MD-468及MCF-7 中lncRNA RP1-85F18.6相对表达量均高于正常乳腺上皮细胞系MCF-10A（均P＜0.05）（图1）。

图1 lncRNA RP1-85F18.6在正常乳腺上皮及乳腺癌细胞系中的表达 Figure1 The expressions of lncRNA RP1-85F18.6 in normal mammary cell line and breast cancer cell lines

2.2 转染效率检测

qRT-PCR结果显示，转染24 h后，沉默组lncRNA RP1-85F18.6相对表达量明显低于空白对照组（P＜0.01），而阴性对照组lncRNA RP1-85F18.6相对表达量与空白对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）（图2），提示转染成功，可行下一步实验。

图2 转染效率检测结果Figure2 Analysis of the transfection efficiency

2.3 lncRNA RP1-85F18.6对乳腺癌细胞增殖的影响

MTT结果显示，在转染后24、48、72、96 h，沉默组OD490nm值均明显低于空白对照组（均P＜0.05），而阴性对照组各时间点OD490nm与空白对照组间差异均无统计学意义（均P＞0.05）（图3）。

图3 各组乳腺癌细胞的增殖曲线Figure3 The proliferation curve of each groups of breast cancer cells

2.4 lncRNA RP1-85F18.6对细胞周期的影响

转染24 h后，空白对照组G0/G1期（49.51±5.12）%，S期（21.26±5.13）%，G2/M期（29.24±1.69）%；阴性对照组G0/G1期（51.91±8.12）%，S期（18.98±3.23）%，G2/M期（30.54±1.89）%；沉默组G0/G1期（50.01±7.54）%，S期（29.96±0.13）%，G2/M期（10.34±1.39）%。与空白对照组比较，沉默组的G1/G0期细胞数比例无明显变化（P＞0.05），S期细胞数比例升高（P＜0.05），G2/M期细胞数比例降低（P＜0.05）。阴性对照与空白对照组间各期细胞比例差异均无统计学意义（均P＞0.05）（图4）。

2.5 lncRNA RP1-85F18.6对细胞增殖及细胞周期相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示，沉默组Ki-67蛋白表达量为0.42±0.25，阴性对照组为1.02±0.56，空白对照组为1.09±0.31；沉默组PCNA蛋白表达量为0.39±0.14，阴性对照组为1.04±0.23，空白对照组为1.12±0.25；沉默组cyclin A蛋白表达量为0.33±0.20，阴性对照组为1.06±0.35，空白对照组为0.95±0.65；沉默组p21C1P1蛋白表达量为2.87±0.49，阴性对照组为1.05±0.45，空白对照组为1.11±0.24。沉默组Ki-67、PCNA、cyclin A蛋白表达量明显低于空白对照组（均P＜0.05），沉默组p21C1P1蛋白表达量高于空白对照组（P＜0.05）；阴性对照组与空白对照组Ki-67、PCNA及cyclin A及P21C1P1蛋白相对表达量差异均无统计学意义（均P＞0.05）（图5）。

图4 细胞周期检测结果Figure4 Results of cell cycle analysis three groups of cells

图5 细胞增殖及细胞周期相关蛋白表达检测 Figure5 Determination of the expressions of proliferation-promoting and cell-cycle-controlling proteins

3 讨 论

肿瘤的发生是个多步骤、多基因、多因素参与的过程[13-14]。原癌基因的激活和抑癌基因的失活在其中起了关键性的作用，乳腺癌也不例外。乳腺癌的发生及进展涉及一系列的分子变异，包括P53、P21、lncRNA分子等。lncRNA是种不能编码蛋白质的RNA，可通过表观遗传调控，转录和转录后的产物调节许多细胞生物学过程。多种lncRNA分子在乳腺癌肿瘤组织中表达异常，可作为癌基因或抑癌基因参与乳腺癌的发生和进展[15]。作为癌基因调控的关键参与者，lncRNA的异常表达与肿瘤筛查、诊断、预后及治疗紧密相关[16]。lncRNA BCRT1通过靶向miR-1303/PTBP3信号轴促进乳腺癌进展[17]。lncRNA NR2F1-AS1与雌激素受体阳性的乳腺癌复发相关[18]。

lncRNA RP1-85F18.6基因位于22号染色体蛋白质编码基因EP300上[11,19]。首次被发现后，lncRNA RP1-85F18.6被报道与肿瘤发展相关。有研究[12]发现lncRNA RP1-85F18.6在结肠癌中高表达，并且在细胞实验中发现沉默lncRNA RP1-85F18.6表达能抑制癌细胞增殖、侵袭和阻滞细胞周期，促进癌细胞凋亡。在本研究中，通过比较lncRNA RP1-85F18.6在乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞系内的表达量，我们发现lncRNA RP1-85F18.6的表达量在乳腺癌细胞系中也呈高表达，结果与结肠癌一致[12]。同时，沉默lncRNA RP1-85F18.6后，MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖被显著抑制，提示沉默lncRNA RP1-85F18.6表达可抑制乳腺癌细胞增殖。

不受控的增殖和细胞周期异常是乳腺癌重要的发病机制。Ki-67和PCNA是反映细胞增殖的重要标志物[20]。在乳腺癌中，Ki-67高表达提示乳腺癌恶性增殖能力强、侵袭力强，与乳腺癌预后不佳相关，为影响预后的独立危险因素[21]。Petrelli等[21]报道Ki-67高表达的乳腺癌患者病死率显著高于Ki-67低表达患者。PCNA是分子量为36kD的DNA聚合酶δ的辅助蛋白，其在细胞增殖启动阶段扮演者重要作用，在S期表达水平最高，G0/G1及G2表达量较低[22]。在结肠癌中，鬼臼苦素可通过下调PCNA、cyclin D1表达，进而抑制结肠癌细胞增殖[23]。在口腔癌[24]、肺癌[25]等多种肿瘤组织中PCNA也呈高表达。本研究中，沉默组Ki-67及PCNA表达量显著低于阴性对照组，提示沉默lncRNA RP1-85F18.6的表达可能通过下调Ki-67及PCNA表达而抑制乳腺癌细胞增殖。

细胞增殖的主要方式为细胞分裂，细胞周期的调控与细胞增殖密切相关。细胞周期分为5期，分别是G0、G1、S、G2和M期[20]。本研究发现，沉默lncRNA RP1-85F18.6可增加MDA-MB-231在S期的细胞比例，并降低G2/M期细胞比例，表明沉默lncRNA RP1-85F18.6可诱导S期细胞比例增加，并阻滞S期向G2/M期进展及有丝分裂，细胞周期进程得以停滞。细胞周期调节复合物（cyclin A1/CDK2/PCNA复合物）的减少及p21CIP1表达上调与细胞周期S期阻滞密切相关[26]，与之相反，p21CIP1可阻滞cyclin A1/CDK2/PCNA复合物，而阻滞细胞从S期进入G2/M期[27]。本研究发现沉默lncRNA RP1-85F18.6的表达后，cyclin A1表达下调，而p21CIP1表达上调，表明沉默lncRNA RP1-85F18.6的表达可通过下调cyclin A1表达及上调p21CIP1表达，而诱导乳腺癌细胞周期发生S期阻滞，并阻止S期进入G2/M期，从而抑制乳腺癌细胞DNA的合成，抑制细胞增殖过程。

综上，本研究发现lncRNA RP1-85F18.6在乳腺癌细胞中上调表达，沉默lncRNA RP1-85F18.6可抑制乳腺癌细胞增殖，诱导细胞周期发生S期阻滞，其机制可能与Ki-67及PCNA下调表达，及cyclin A1下调和p21CIP1上调有关。对lncRNA RP1-85F18.6及其相关靶基因的干预可能为乳腺癌的治疗提供新的途径。

本研究存在一定的不足，首先，细胞培养环境与细胞体内生长微环境有一定的不同，且本研究使用的细胞系只能代表一部分类型的乳腺癌细胞；此外，lncRNA RP1-85F18.6调控机制及更多的上下游靶点，都需要进一步研究；未来笔者将在该领域进行更深入的探讨。