脂氧素A4在结核性胸膜纤维化中的表达水平及影响机制初探

朱建坤 孟倩 金锋

结核性胸膜炎患者出现胸膜纤维化在临床上比较常见，表现为胸膜增厚，部分形成脓胸包裹，导致胸廓塌陷或肺膨胀不全，治疗非常棘手。转化生长因子β(TGF-β)是促进胸膜纤维化的重要细胞因子之一，而脂氧素A4(LXA4)具有抑制促炎因子的表达，调节免疫应答等作用，并且在肺、结肠、肾等器官中具有抗纤维化的作用[1-3]，但在结核性胸膜纤维化进程中的表达及影响机制尚未有研究。本研究通过检测61例结核性胸腔积液患者胸腔积液中LXA4的浓度，分析LXA4与结核性胸膜纤维化的关系，并通过研究LXA4与TGF-β的相关性探讨LXA4在结核性胸膜纤维化进程中的影响机制。

资料和方法

一、研究资料

(一)患者来源

选择2017年7月至2018年12月山东大学附属山东省胸科医院收治的76例胸腔积液患者。其中，结核性胸腔积液患者61例；男22例，女39例；年龄21～65岁，平均(30.2±4.7)岁。癌性胸腔积液患者15例；男9例，女6例；年龄56～67岁，平均(65.1±3.8)岁。

(二)诊断标准

1. 结核性胸腔积液诊断标准：(1)胸膜活检发现结核结节；(2)胸腔积液或痰液找到抗酸杆菌；(3)肺部有活动性结核病灶；(4)临床结核中毒症状明显，胸腔积液呈渗出性改变；(5)经抗结核药物治疗后症状好转，胸腔积液吸收快；(6)经追踪观察并排除其他疾病。具备上述诊断标准中3项或3项以上即可确诊。

2. 癌性胸腔积液的诊断标准：(1)胸腔积液中查到癌细胞；(2)胸膜活检或肺活检病理检查明确诊断。具备上述诊断标准的任意一项可确诊。

3. 分组标准：结核性胸腔积液患者中，胸腔积液为包裹性，胸膜增厚>5 mm者，列入结核性胸膜纤维化组(简称“结核纤维化组”)，共27例；无胸膜增厚，或胸膜增厚<5 mm者，列入无结核性胸膜纤维化组(简称“结核无纤维化组”)，共34例；癌性胸腔积液患者均无胸膜增厚，共15例，列入癌性无纤维化组。

二、研究方法

1. 标本的收集：所有患者均在B超引导下行胸腔穿刺，抽取胸腔积液20 ml，以10 000×g离心 10 min 后，取上清液置-20 ℃冰箱保存待测。

2. 标本的检测：LXA4及TGF-β采用标准试剂盒，应用酶联免疫检测仪测定。基本步骤包括：(1)包被：用碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10 μg/ml。在聚苯乙烯酶标板的每孔加100 μl稀释后的抗体，4 ℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 min。(2)封闭：每孔加入200 μl封闭液，37 ℃孵育1～2 h。(3)洗涤：小心揭掉封板膜，放入洗板机，洗涤3～5遍；也可以手动洗板，步骤为：弃去液体，每孔加入300 μl洗液，浸泡1～2 min，在吸水纸上拍干，重复3～5遍。(4)加样：加适当稀释的待检样品100 μl于上述已包被的反应孔中。(5)温育：用封板膜封板后置37 ℃孵育1～2 h。(6)洗涤：同步骤3。(7)加抗体：于各孔中加入稀释好的生物素化抗体工作液100 μl。(8)温育：用封板膜封板后置37 ℃孵育1 h。(9)洗涤：同步骤3。(10)加酶结合物：于各孔中加稀释好的酶结合物工作液100 μl。(11)温育：用封板膜封板后置37 ℃避光孵育30 min。(12)洗涤：同步骤3。(13)加显色底物：于各孔中加入3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液100 μl，37 ℃避光反应10～30 min，直到倍比稀释的标准品孔出现明显的颜色梯度为止。(14)终止反应：于各反应孔中加入终止液硫酸100 μl，至颜色由蓝色变为黄色为止。(15)结果测定：10 min内，在酶标仪上于450 nm处，以空白对照孔调零后测各孔吸光度(A450)值。

3. 酶联免疫分析结果：酶联免疫试剂盒由武汉赛维尔生物科技有限公司提供。根据试剂盒自带标准曲线方程，以标准品的浓度和A450制作标准曲线，再根据标准曲线方程计算出样本浓度。具体操作由武汉赛维尔生物有限公司完成。

三、统计学处理

结 果

结核无纤维化组LXA4浓度为7.74(4.69，10.55) ng/L，明显低于结核纤维化组[12.50(11.60，14.83) ng/L]，差异有统计学意义(Z=-3.830，P<0.001)。癌性无纤维化组LXA4浓度为7.88(5.91，15.02) ng/L，与结核无纤维化组[7.74(4.69，10.55) ng/L]比较，差异无统计学意义(Z=-0.586，P=0.558)。

以61例结核性胸腔积液患者的LXA4浓度为纵坐标，以TGF-β浓度为横坐标，绘制散点图，散点图显示两者之间具有相关性。正态性检验显示两变量均呈偏态分布，Spearman相关系数检验显示，LXA4浓度[10.23(5.14，13.15) ng/L]与TGF-β浓度[46.30(41.04，60.85) ng/L]呈负相关性(rs=-0.519，P<0.001)。见图1。

图1 61例结核性胸腔积液患者LXA4与TGF-β浓度散点图

讨 论

LXA4为花生四烯酸代谢产物，广泛存在于单核细胞、多形核白细胞、气道上皮细胞和血管内皮细胞中，通过抑制中性粒细胞在炎性反应部位的聚集，调节促炎、抗炎因子的平衡，限制炎性反应损伤，调节组织修复，促进单核巨噬细胞的趋化和巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的清除等，发挥抗炎及促进炎症消退的作用。在内毒素肺损伤、肾小球肾炎、哮喘、腹膜炎等多种与炎症有关的疾病模型中，脂氧素促进炎症消退的作用都得到了证实[4]。吴志军和邹海[5]报道，在结核性胸膜炎患者中，外周血和胸腔积液中的LXA4明显升高，且与结核病病情控制情况相关，认为LXA4可抑制肿瘤坏死因子α、白细胞介素1等促炎因子的表达及调节免疫应答，可作为结核性胸膜炎治疗效果的评价指标。在本研究中，结核无纤维化组与癌性无纤维化组患者胸腔积液中LXA4浓度差异无统计学意义，但结核纤维化组患者的LXA4浓度明显高于结核无纤维化组患者，证实LXA4参与了结核性胸膜炎胸膜纤维化反应，并且其水平与胸膜纤维化程度相关。

LXA4通过分布于肺、肝、脾、肠道等器官的受体细胞，如中性粒细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等，在肺、结肠、肾等器官中具有抗纤维化的作用。LAX4通过抑制细胞因子信号传导抑制蛋白(SOCS)调节Janus激酶(JAK)/信号转导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)信号通路(JAK/STAT信号通路)，缓解肾脏的纤维化，而阻断TGF-β及其下游Smad3(细胞内重要的TGF-β信号转导及调节分子)信号通路，被认为是LXA4抗结肠纤维化作用的机制之一[2]。在博莱霉素诱导肺纤维化的小鼠模型中，注射博来霉素并同时注射脂氧素(lipoxins，LXs)可使肺组织炎性细胞浸润及水肿明显减轻，肺泡数量增多，细胞外基质沉淀减少，证明 LXA4有减轻并逆转肺纤维化的作用，还可以拮抗结缔组织生长因子(CTGF)诱导的信号转导和转录激活因子3(STAT3)与DNA结合的活性，缓解肺纤维化的进程[6]。

关于LXA4的抗纤维化作用是否在结核性胸膜炎患者中同样适用，本研究发现，61例结核性胸腔积液患者LXA4与TGF-β的相关性分析结果显示，LXA4与TGF-β呈现明显负相关性。而TGF-β已被证实在胸膜纤维化中起着重要的作用，TGF-β作为成纤维细胞的趋化因子，募集成纤维细胞进入胸膜腔，刺激胸膜间皮细胞(PMC)产生血管内皮生长因子，刺激胸膜血管新生，诱导PMC胶原蛋白合成，抑制其降解，刺激PMC产生纤溶酶原激活物抑制剂，抑制纤维蛋白溶解，促使胸膜发生纤维化[7]。由于本研究显示LXA4与TGF-β在胸膜纤维化进程中具有明显负相关性，推断LXA4可能也通过抑制TGF-β/Smads信号通路发挥抗胸膜纤维化作用。Smad 2/3是TGF-β特异性Smad受体，LXA4可抑制Smad 2/3分子的表达和核转位，发挥抗TGF-β促胸膜纤维化反应的作用[3, 8]。李淑君等[9]研究表明，LXA4可抑制TGF-β诱导的TGF-β受体的表达，LXs受体激动剂可减少α平滑肌肌动蛋白的表达及胶原沉积，下调TGF-β的表达。Börgeson等[10]研究发现，在体外环境中，LXA4抑制了TGF-β诱导的Smad 2的活性，可以缓解肾脏纤维化的病理进程。在腹膜纤维化模型中应用超声微泡阶段Smad 7基因转染，抑制TGF-β的信号传导可减轻腹膜纤维化[11]。结肠的纤维化延缓亦与LAX4阻断TGF-β及其下游Smad 3信号通路有关。

同时，由于结核病为T淋巴细胞介导的免疫反应，TGF-β通过抑制T淋巴细胞的增殖及其功能，或通过细胞表面诱导凋亡因子(FAS)及其配体(FASL)系统调节T淋巴细胞和其他免疫细胞的凋亡；促进结核分枝杆菌的胞内生长，影响结核病的病情转归[12]。TGF-β所介导的免疫反应还参与了结核肉芽肿的形成。LXA4通过抑制TGF-β，提高巨噬细胞抗分枝杆菌的活性，恢复细胞对结核分枝杆菌的反应，并提高巨噬细胞对结核分枝杆菌的杀伤能力[13]。LXA4可以与多种免疫细胞、免疫调节介质之间存在密切联系，调节免疫应答，在结核性胸膜炎患者胸膜纤维化进程中发挥作用。

综上所述，LXA4在结核性胸膜炎胸膜纤维化患者中存在高表达，且与TGF-β具有明显负相关性，LXA4可能通过作用TGF-β及下游Smad通路，发挥抗胸膜增厚及纤维化的作用，但其机制尚需通过进一步的研究加以验证。

志谢山东大学高琦老师对本文统计学方法和内容进行了悉心指导和修改！