山东省副猪嗜血杆菌流行现状调查及启示

宁慧波，王 鹏，刘 伟

[1.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193；2.海博莱生物科技咨询（北京）有限公司，海淀 100086]

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）自1910年以来就被认为是猪格拉瑟氏病（Glässer's disease）的病原菌。该菌是上呼吸道的常在菌，通常定植在猪的鼻腔、扁桃体、气管前段等部位，与猪的免疫系统保持着脆弱的平衡状态。在应激等多种因素作用下，Hps可突破鼻黏膜的屏障，引起全身性的感染。临床上主要表现为浆液性纤维蛋白性-化脓性多发性浆膜炎、多发性关节炎、脑膜炎、支气管肺炎和败血症[1]。

猪是Hps的天然宿主。该病主要通过空气传播，一年四季均可感染，临床上主要感染2周至4月龄的猪，尤其是5～8周龄仔猪。发病率在10%～15%，有窝发特点，死亡率可高达50%以上[2-3]。临床死亡率取决于猪群感染菌株的毒力、仔猪的免疫力、猪群中并存病毒等其他病原体的稳定性及宿主遗传抗性[4]。

随着规模化养猪的发展，此病的发病率和死亡率均呈显著上升趋势。猪只即使能耐过，也会造成生长发育不良，因此Hps可给养猪业造成严重的经济损失。美国、加拿大、西班牙等养猪业较发达国家早已有此病的报道，我国是世界上的养猪大国，由于多种病毒病的存在，导致养殖场对该病的防控并不予以重视。本研究通过临床剖检、PCR方法、细菌分离鉴定和药敏试验初步了解山东省副猪嗜血杆菌病最新流行及耐药情况，为山东省副猪嗜血杆菌病的防控提供数据参考。

1 调查对象

从2017年10月至2018年5月，对山东省20家规模化猪场（存栏母猪＞500头）进行现场调查，对疑似发病猪剖检进行初步诊断。发病猪多表现为发热、咳嗽、打喷嚏、呼吸困难、鼻腔有分泌物，消瘦（图1）、生长缓慢、跛行等症状。部分病猪剖检可见腹股沟淋巴结肿大出血（图2）；脾脏边缘出血（图3）；肿胀关节切开呈胶冻样，关节腔内有浆液性炎性渗出液（图4）；心外膜与心脏粘连在一起，形成“绒毛心”状（图5）；腹腔内脏器官粘连，呈现纤维性腹膜炎（图6）；肝脏表面覆有一层干酪样渗出物，形成肝周炎（图7）。参照Magyara及Donkó等[5-6]的方法：沿第1、第2前臼齿之间垂直锯开猪鼻进行鼻甲骨病变评分，呈现重度萎缩（图8）。

2 临床材料

分别从20个调查猪场剖检采集病料，从心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腹腔积液和关节液等部位无菌操作取样。

3 实验室检测

3.1 主要试剂

TSA（胰蛋白胨大豆营养琼脂培养基）、TSB（胰蛋白胨肉汤营养琼脂培养基）、NAD（氧化型辅酶1，终浓度终浓度0.1 g/mL）、犊牛血清（终浓度10%）、1×PBS、1.5%琼脂糖凝胶。

3.2 PCR检测

采取病猪淋巴结、肺脏、大脑研磨提取DNA/RNA，进行PCR检测，具体见表1。

表1 PCR/RT-PCR引物片段

3.3 组织病理学检测

对剖检猪的脑、肺、淋巴结及扁桃体取样，10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡切片，HE染色，镜检。

3.4 细菌分离鉴定

将无菌采集的猪心包液、关节液等分别接种于血琼脂培养基，37℃培养48 h，挑取可疑单个菌落进行纯培养。挑取菌落涂片，经革兰氏染色、镜检。

3.5 药敏试验

通过PCR鉴定菌株的悬液，将TSB纯培养物吸取0.2 mL无菌棉棒涂布含犊牛血清（终浓度10%）和NAD（终浓度0.1 g/mL）的TSA培养基，待干后，用无菌镊子将药敏片等距平贴于培养基表面，置37℃培养24～48 h后观察结果。判定标准：抑菌圈直径d≥20 mm为高度敏感，15 mm＜d＜20 mm为中度敏感，d≤15 mm为低度敏感，无抑菌环为不敏感。选取药物为：头孢噻呋钠30 μg/片、强力霉素30 μg/片、氟苯尼考 30 μg/片、恩诺沙星 5 μg/片、阿米卡星 30 μg/片、阿莫西林 10 μg/片、庆大霉素 10 μg/片。

4 结果

4.1 临床剖检调查结果

现场剖检发现，40%的猪场存在典型的副猪嗜血杆菌发病症状，如胸腹腔积液、肝周炎、心包炎等。所调查的猪场100%存在萎缩性鼻炎感染发病的情况，并且鼻甲骨均为重度萎缩。

4.2 PCR检测结果

经PCR检测，Hps的检出率为45%（图9），蓝耳病的检出率为 40%（图 10），55.56%（5/9） 的 Hps感染猪场存在蓝耳病混合感染现象。

4.3 组织病理学检测结果

镜检可见化脓性脑膜炎病变，脑膜血管充血，大量中性粒细胞浸润（图11）；肺泡壁毛细血管充血，肺泡腔和支气管内大量中性粒细胞浸润（图12）；淋巴结呈浆液性淋巴结炎病变，淋巴小梁及实质中毛细血管充血，水肿（图13）；扁桃体毛细血管充血，隐窝扩张，内含中性白细胞（图14）。

4.4 细菌分离鉴定结果

TSA培养基可见无色透明、边缘整齐的小菌落（图15）；革兰氏染色可见散在丝状、大小不等的革兰氏阴性细小杆菌（图16）。

细菌分离培养发现，35%的猪场存在副猪嗜血杆菌的感染，其中部分剖检存在典型副猪嗜血杆菌感染的猪场未分离出该菌，这与抗生素的治疗使用或许存在一定关系。另外部分剖检未发现典型副猪嗜血杆菌感染的猪场分离出该菌，这或许与感染的副猪嗜血杆菌血清型存在一定联系。对于副猪嗜血杆菌某些血清型，如 3、6、7、9、11 型，猪感染后通常无明显临床症状及病理变化。

4.5 药敏试验结果

药敏试验结果显示，分离到7株副猪嗜血杆菌整体对恩诺沙星、头孢噻呋钠高度敏感；对阿米卡星、庆大霉素中度敏感；对阿莫西林、氟苯尼考、强力霉素低度敏感（表2）。

表2 药敏试验结果 mm

5 调查启示

5.1 Hps在山东省规模化猪场广泛存在

本次调查中，现场剖检发现，40%的猪场存在较为典型的Hps病理变化；通过对病料进行PCR鉴定，45%的猪场病料为阳性；通过细菌分离培养，35%的猪场分离到该菌。3种诊断方法的结果一致表明，Hps在山东省规模化猪场普遍存在。

5.2 临床混感较为普遍

Hps是一种上呼吸道的常在菌，也是一种条件性致病菌，在不利的饲养环境、应激及其他病原菌侵袭下，可突破鼻黏膜屏障，引发全身性的感染。所以临床上该菌常与萎缩性鼻炎、蓝耳病、圆环病毒病等疾病混合感染[7-9]。锯鼻结果显示，所有猪场均存在重度萎缩性鼻炎病变；PCR鉴定结果显示，55.56%的Hps感染猪场存在蓝耳病混合感染现象；应引起高度重视。

5.3 抗生素预防及治疗效果不佳

猪细菌病可以选用敏感药物来预防及治疗，但是Hps的耐药性产生较快，大量长期使用抗生素会造成药物的敏感度日趋下降，从而影响该病的防控效果[10-11]。另外，Hps属于革兰氏阴性菌，被抗生素杀灭的同时会释放内毒素，使机体发热，容易造成多重感染。尽管抗生素可以杀灭细菌，但是其不能抑制内毒素的生物活性。此次调查的猪场均在哺乳仔猪阶段进行了药物预防，从发病率来看，药物预防效果并不理想。对分离菌株进行的药敏试验，进一步说明了该菌的耐药性较强。

5.4 临床剖检需与其他疾病鉴别诊断

临床剖检疑似Hps感染病例多以纤维素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、脑膜炎、关节炎等为特征。但这些全身性感染的临床症状及病变并非该病原的特异性变化。非溶血性大肠杆菌、放线杆菌、猪鼻支原体会引发纤维素性多浆膜炎[12]；链球菌、猪丹毒、猪滑液支原体可以引发跛行与关节炎[13]；猪伪狂犬病病毒及链球菌会引发中枢神经系统症状；因此诊断时需要与其他病原进行鉴别诊断。如不能确诊，可以通过PCR和细菌分离等方法进行确诊，以避免因误诊而造成不必要的损失[14]。

5.5 实验室检测工作繁琐且要求严格

现实生产中可以通过猪群的临床症状及病理剖检进行初步诊断。如要确诊，还需要通过PCR、组织病理学及细菌分离培养等方法。临床采集的病料可以直接用于PCR检测，若要进行药敏试验或细菌分型，则需要进行细菌分离培养。但是Hps生长条件要求苛刻、生长速度缓慢、死亡快，培养难度较大[15]。细菌培养时首先应选取临床症状典型且未经过抗生素治疗的发病初期的病猪，用棉拭子在心包、关节、脑膜等封闭状态部位采集。鉴于Hps是上呼吸道的常在菌，健康猪的鼻腔、扁桃体、气管部位可分离出该菌；尽管其可以引发肺炎，但未必是引发肺炎的真正病原，可能是猪感染其他病原或者死亡后，该菌沿呼吸道下行侵入的，故临床中一般不建议肺组织采样。由于该菌很难在室温下存活，所以采集的病料应12～24 h内尽快送检，以提高细菌的检出几率。

5.6 需采取更合理有效的方法进行防控

我国养猪水平逐年提升，但是作为常在菌和条件性致病菌的Hps，在猪群受到各种应激或者其他疾病感染时，其常常并发或者继发而在临床中呈现，给猪场的疾病防控带来了很大的困扰。尽管可以采取口服或者肌注抗生素来预防，但必须要在临床症状出现前使用才会有效果；而一旦该菌进入了浆膜、脑组织及关节后，抗生素将难以发挥作用。长期使用抗生素预防势必造成耐药性的增强，并且治疗时会产生内毒素，最终影响治疗效果。因此，需采取更加合理有效的防控手段。

在猪场生产中，Hps在猪群中反复循环，可以通过水平传播和垂直传播。出生1周龄内的仔猪，其鼻腔黏膜很容易存在该菌的寄生。因此，来自母猪的母源抗体和天然免疫是控制该病的关键性因素[15]。母猪免疫不仅能减少降低本身感染的几率，同时也能减少仔猪上呼吸道Hps的定居数量以及定居菌株的血清型种类[16]，从而降低仔猪全身性感染的风险。通常情况下，母猪未免疫，其母源抗体一般2周内消退非常明显；而母猪免疫，其母源抗体可对6周内的仔猪产生保护。若仔猪后期感染压力较大，可考虑对2～3周龄仔猪进行免疫。

Hps血清型众多，尽管目前定型的有15种，但是依然有20%以上的菌株不能分型。虽然我国分离的血清型和欧美报道的一致，都是以4型和5型为主[17-18]，但是一个猪群中常出现几个菌株或血清型，甚至在单个猪上不同部位可以分离多个菌株或血清型[19]。所以，选择具有良好交叉免疫力的菌株及血清型的疫苗尤为重要[20]。

6 小结

近几年，我国养猪产业取得了快速的发展，但副猪嗜血杆菌病已成为规模化猪场主要的细菌性传染病之一，该病的高发病率和死亡率使广大猪场蒙受较大的经济损失，同时也使得猪场耐药性及用药成本增加的现象频频发生。本次调查研究发现山东省规模化猪场普遍感染副猪嗜血杆菌，并存在与猪萎缩性鼻炎、蓝耳病混合感染的情况；分离菌株的耐药性较为严重。该研究为副猪嗜血杆菌的流行病学研究奠定了基础，也为该病的临床预防提供了理论依据。

病毒是否通过粪口传播待查

这两天在湖北省武汉市、广东省深圳市甚至在美国的首例病例中都在确诊患者的粪便中检测到了新型冠状病毒核酸。2月2日，在国家卫健委新闻发布会上，中国疾控中心传染病处研究员冯录召表示，这个现象说明了病毒可以在消化道复制并且存在，但是不是通过粪口传播，或者通过含有病毒的飞沫形成气溶胶的方式再传播，需要流行病学调查和研究进一步证实这个现象。国家卫健委疾控局副局长王斌表示，随着假期临近结束，各行各业的人陆续返回工作岗位。针对这样一个防控形势，已针对不同人群，分类制定了不同的防护规范和指南。

（摘自《健康报》2020.02.03叶龙杰/文）