一株仔猪源枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其益生特性研究

2020-06-12卢冰霞周英宁梁家幸秦毅斌陈忠伟蒋冬福段群棚

养猪 2020年3期

卢冰霞，周英宁，梁家幸，秦毅斌，陈忠伟，何颖，赵硕，蒋冬福，李斌，段群棚，刘磊，3，赵武

（1.广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001；2.广西大学，南宁 530005；3.广西农业职业技术学院，南宁 530007）

现代养殖业不断向规模化、集约化的方向发展，但伴随着养殖业的快速发展，动物疫病也愈发复杂，已成为限制养殖业健康可持续发展的重要因素。养殖业为了“防病治病”，大量滥用抗生素的现象十分普遍[1]。抗生素滥用会引起细菌耐药性增强、免疫抑制、药物残留等一系列问题，严重威胁养殖业的健康发展和人类的健康。研究开发抗生素替代品、推广使用绿色添加剂是当前研究的热门，也是未来研究的方向[2]。益生菌是一类有益于宿主的活性微生物的总称，它们定植于动物肠道、生殖系统内，能够发挥改善宿主微生物生态平衡、促进营养吸收等有益作用。益生菌以其安全、增强免疫力、促进生长、抑制病原菌等优势，作为理想的抗生素替代品而被广泛应用[3-5]。芽孢杆菌是一种好氧的革兰氏阳性菌，有芽孢，能够耐高温、耐酸且方便保存，是当前应用广泛的一种益生菌[6]。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌的一种，因具有改善消化道内环境、促生长、提高免疫力及生产多种酶类或提高消化酶活性等功能而广泛应用[7]。虽然市面上也有较多商品化的添加于猪饲料中的枯草芽孢杆菌，但源于动物尤其是来源于猪的枯草芽孢杆菌益生菌菌种鲜见报道。非动物来源的枯草芽孢杆菌在动物肠道中定殖力难，无法发挥其生物活性[8-9]，因此开展动物源益生菌的筛选与研发十分必要。本研究从某规模猪场健康猪的新鲜粪便中分离鉴定获得1株枯草芽孢杆菌，并研究其部分生物学特性及其益生性能，为下一步鉴定其是否能成为益生菌候选菌株奠定基础，也为进一步研究与开发畜禽微生态制剂提供菌种资源和理论依据及技术支持。

1 材料与方法

1.1 样品与试验动物

试验于2019年6月10日至2020年4月2日在广西壮族自治区兽医研究所进行。健康仔猪的新鲜粪便，采自广西某规模化养猪场；6周龄健康小鼠，体重18～22 g，由广西医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂

胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）购自北京陆桥技术有限公司；猪胆盐购自北京索莱宝科技有限公司；革兰氏染液、芽孢染液、生理生化试剂，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；DNA抽提试剂盒为Axygen生物科技有限公司产品。

1.3 菌株的分离鉴定

1.3.1 样品采集采集健康仔猪新鲜粪便，按照1∶5的比例使用无菌的PBS混匀后，于85℃水浴加热20 min，取1 mL上清液进行10倍系列的梯度稀释，得到10-1～10-4一系列不同浓度的菌源稀释液。

1.3.2 菌株的分离无菌吸取上一步骤各稀释度的菌源稀释液接种于TSA平板的表面，每个平皿接种3个稀释度，每组设3个重复，37℃静置培养24 h。

1.3.3 分离菌的纯化挑取步骤1.3.2中的单菌落，划线接种TSA平板37℃培养24 h，重复划线接种培养3次，得到纯的分离菌。选取菌落形态典型的单个菌落加入4 mL TSB培养基中，37℃培养24 h，得到的培养物扩大培养后用于下面的鉴定和益生特性研究。

1.3.4 分离菌培养特性与形态观察取10 μL纯培养的菌液，用适量生理盐水稀释后涂片，进行革兰氏染色和芽孢染色，显微镜下观察细菌染色情况及形态特征。

1.3.5 分离菌生理生化鉴定对分离获得的菌株进行接触酶试验、明胶液化、V-P试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、卵磷脂酶试验、7%氯化钠试验、柠檬酸盐试验、葡萄糖试验、甲基红试验、丙酸盐试验及运动性检验试验等，根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》（9版）对分离菌的种属进行初步鉴定。

1.3.6 分离菌分子生物学鉴定按照DNA抽提试剂盒中的方法提取分离菌DNA。以分离菌的DNA作为模板，PCR扩增其16S rDNA序列。PCR引物为扩增细菌16S rDNA的通用引物，序列为：27F 5'-AG AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和1492R 5'-TACGGY TACCTTGTTACGACTT-3'（由上海生物工程有限公司合成），扩增目的片段长度约1 500 bp。采用25 μL PCR反应体系：2xF8FastlongPCR MasterMix 12.5 μL，25 μmol/L 上、下游引物各 0.5 μL，灭菌水 8.5 μL，模板 3.0 μL。反应程序为：94 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s，退火温度10 s，72℃ 10 s，30个循环；72℃最后再延伸10 min。取10 μL PCR扩增产物于1.0%的琼脂糖凝胶中电泳并观察结果。

将阳性PCR产物送上海生物工程有限公司进行序列测序，再利用生物学软件Meglin对测序所得序列进行核苷酸同源性比对分析，并运用MAGA 7.0进行系统进化树的构建，确定分离菌株的类别。

1.4 分离菌的益生特性研究

1.4.1 耐酸性研究用0.1 mol/L盐酸调节TSB培养基 pH 为 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 和 4.0（每个 pH 3 个重复，每个重复1个样品），分别按1∶100加入纯化的分离菌，37℃处理4 h后取菌悬液，用涂抹平板法计数，以自然pH下的菌悬液为对照，37℃培养24 h，分别计算存活率。存活率（%）=[1－（对照组含菌量－不同条件处理后含菌量）/对照组含菌量]×100%。

1.4.2 耐胆盐性研究 TSB培养基加入猪胆盐使其质量分数为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%，灭菌后分别按1∶100加入纯化的分离菌，37℃培养24 h，以不加猪胆盐的培养基作为对照组，每种浓度3个重复，每个重复1个样品。用涂平板法计活菌数。1.4.3 耐热性能研究取纯化的分离菌（每个温度1 mL）分别置于 70、75、80、85、90 和 95 ℃的水中放置10 min，取出冷却至室温，用涂抹平板法计数，以室温下的菌悬液为对照组。每个处理温度3个重复，每个重复1个样品。

1.5 抗致病菌活性测定

致病菌为本实验室保存的猪源大肠杆菌和沙门氏菌，采用牛津杯法进行抗致病菌测定试验。分别取100 μL大肠杆菌和沙门氏菌到两个TSA平板上，用三角形涂布器涂布均匀，将6个牛津杯均匀插在TSA平板的琼脂里，然后在每个牛津杯中加入200 μL纯化的分离菌，37℃培养24 h，测定抑菌圈的直径大小。

1.6 分离菌的药敏试验

采用K-B纸片扩散法，取100 μL纯化的分离菌（浓度约为1.0×108CFU/mL）涂布于TSA平板上，静置5 min后，用镊子将药敏纸片均匀贴到琼脂表面（每个平板贴9种药物），37℃倒置培养过夜，判断标准按2010版CLSI M100-S20执行。

1.7 动物安全性试验

将小鼠分为2组，每组5只，第1组为试验组，第2组为对照组。试验组分别喂服纯化的分离到的菌株（浓度约为 1.0×108CFU/mL，按 1∶10 稀释，注入饮水混匀），2次/周；对照组喂服生理盐水。观察小鼠的状态，记录小白鼠的发病、死亡等情况，试验时间为4周。

2 结果与分析

2.1 分离菌株形态特征及染色结果

在TSA平板上从健康仔猪粪便中分离培养出多株分离菌，经过多次连续划线培养，分离到多个纯化的菌落。选取生长快速、形态特征好的一株优秀菌进行扩大培养，用于后续试验。分离菌在TSA平板上呈乳白色，不透明，边缘不规则，表面有褶皱，容易挑起（图1）。革兰氏染色后镜检，菌体形态呈长杆状，革兰氏阳性菌（图2），芽孢染色呈绿色，芽孢所占比例较大，基本位于一侧（图3）。符合芽孢杆菌的特征。

2.2 分离菌生理生化鉴定结果

生化试验结果表明，分离菌株能发酵蔗糖、麦芽糖、果糖、甘露醇和葡萄糖，能水解淀粉，甲基红试验、接触酶试验、明胶液化试验、V-P试验、硝酸盐还原试验和柠檬酸盐试验均为阳性，依据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》（9版）可初步鉴定分离菌为芽孢杆菌属，命名为Y1，分离菌Y1的部分生理生化结果见表1。

表1 分离菌生理生化试验结果

2.3 分离菌Y1分子生物学鉴定结果

分离菌Y1 PCR扩增产物目的片段大小约为1 500 bp（图4），对分离菌Y1的16S rDNA测序序列用生物学软件Meglin进行序列核苷酸同源性比对分析。分析结果表明，与枯草芽孢杆菌序列同源性为99.60%～100%。利用MEGA 7.0软件构建遗传进化树，结果显示，分离菌Y1与枯草芽孢杆菌（MH210872.1和DQ444283.1）亲缘关系最近，在同一进化树分支上（图5）。

2.4 分离菌Y1部分益生特性研究结果

2.4.1 耐酸性从图6可见，分离菌Y1在pH为1.0～5.0的TSB培养基中37℃处理4 h后进行计数，随着pH的降低，分离菌Y1的存活率也降低，当pH为2.0时，存活率平均值仍能达到82.7%。当pH为1.0时，存活率明显降低，表明超低pH对分离菌Y1的活性有较大影响，但其存活率平均值仍能达到28.2%，表明分离菌Y1具有较强的耐酸性能。

2.4.2 耐胆盐性从图7可见，分离菌Y1在不同含量猪胆盐的TSB培养基37℃培养24 h后进行计数，结果显示，其存活率随着猪胆盐质量分数的增加而下降，但浓度为0.6%时存活率平均值仍能达到60.5%，表明分离菌Y1具有较强的耐胆盐性能。

2.4.3 耐热性从图8可见，分离菌Y1在70、75、80、85、90和95℃的水浴中放置10 min后再进行计数，结果表明分离菌Y1具有一定的耐热性能，存活率随着水浴温度的增加而下降，80℃以下存活率很高，存活率平均值在94.5%以上，85℃以上存活率下降快，95℃时的存活率平均值为19.8%，表明分离菌Y1具有较强的耐高温性能。

2.5 抗致病菌活性测定结果

牛津杯法测定结果为：分离菌Y1抑制大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径平均值分别为14.56 mm和18.29 mm，说明分离菌Y1能够一定程度地抑制病原菌大肠杆菌和沙门氏菌的生长，且抑制沙门氏菌的效果略好于抑制大肠杆菌的。

2.6 药敏试验结果

药敏试验结果显示，分离菌Y1对试验用大部分抗生素较敏感，如对大观霉素、阿奇霉素、庆大霉素、强力霉素等；对头孢唑啉、阿莫西林、杆菌肽、链霉素等药物中度敏感；仅对青霉素G、土霉素和金霉素耐药。具体结果见表2。

表2 分离菌Y1药敏试验结果

2.7 动物安全性试验结果

试验组小鼠与对照组相比，试验期间均采食正常、精神良好，无一死亡，说明分离到的枯草芽孢杆菌具有良好的安全性。

3 讨论

动物的消化道是获取益生菌菌种的重要来源之一[9]。本试验从临床健康仔猪的粪便中获得多株芽孢杆菌，选取其中1株生长快速、形态特征典型的菌株进行研究。其形态特征、生理生化及分子生物学鉴定结果与钟罗华等[1]、魏珊珊等[10]报道的研究结果相符，确定该分离菌为枯草芽孢杆菌，并对其益生特性进行研究，评价其作为畜禽微生态制剂菌种的潜在价值。

因芽孢杆菌具有改善动物肠道微生态平衡、促进动物生长、提高免疫力和减少相关疾病和安全等多重益生功效，已然是当前动物饲料中应用最广泛的一种益生菌[7]。章文明等[11]的研究表明，饲喂与动物同源的益生菌才能使其更好地定殖于动物肠道内并抢夺附着点而发挥益生效应。同时，同源性菌株还应具有安全性高、免疫原性低等优点，才能作为微生态制剂的益生菌株。因此安全、高效同源益生菌的筛选和培育研究开发饲用益生菌添加剂是研究重点[12]。饲料中添加的益生菌要想定殖于肠道而发挥其益生作用，必须能经受住胃中恶劣的强酸性环境和十二指肠中胆汁的破坏[6]。本试验分离获得的枯草芽孢杆菌菌株耐酸性试验表明，其经pH 2.0的TSB处理4 h后，存活率平均值仍能达到82.7%，表明菌株具有较好的耐酸特性。分离菌菌株耐胆盐试验表明，在含0.6%猪胆盐的TSB培养基培养24 h后，其存活率平均值仍能达到60.5%，表明其具备较强的耐胆盐性能，为其进入动物机体后耐受肠道内胆盐的破坏提供了保障。分离菌其良好的耐酸性和耐胆盐特性为其益生作用奠定了基础。分离菌菌株耐热试验表明，分离菌在90℃的水浴中放置10 min后，其存活率平均值仍能达到54.5%，表明分离菌具有较强的耐热性能，符合饲料加工工艺的要求。对致病菌的抑制作用试验表明，分离菌能够一定程度地抑制病原菌大肠杆菌和沙门氏菌的生长，对猪肠道可以起到一定的保健作用。分离菌药敏试验结果表明，分离菌对试验用大部分抗生素较敏感，仅对青霉素G、土霉素和金霉素耐药，可能是猪场长期使用或者在饲料中添加这3种抗生素，导致分离的枯草芽孢杆菌对其耐药。此外，动物试验表明分离菌对试验小鼠无毒副作用，具有较好的安全性。综上所述，本试验分离得到的枯草芽孢杆菌符合作为益生菌候选菌株的必要条件，可成为畜禽微生态制剂的供试菌株，为进一步研究与开发畜禽微生态制剂提供菌种资源和理论依据及技术支持。

4 结论

本试验从健康仔猪新鲜粪便中分离获得一株细菌，根据形态特征、生化及分子生物学鉴定，确定该分离菌为枯草芽孢杆菌。该分离菌具有如下优势：菌株菌落大，生长快速，耐85℃以上热处理，耐酸（pH为2.0）处理，耐0.6%猪胆盐处理。同时具有一定的拮抗致病菌的作用，对大部分抗生素敏感，具有作为优良益生菌候选株的优势。本试验丰富了猪源枯草芽孢杆菌益生菌菌种候选资源，为畜禽益生菌制剂的研发提供了优质候选供试菌株。

铜镀层能杀灭新冠病毒

【澳大利亚《悉尼先驱晨报》网站4月15日报道】题：镀铜门把手能杀死新冠病毒？科学家说，有道理（记者利亚姆·曼尼克斯）

镀铜门把手成了全球抗疫的最新武器。

墨尔本一家三维打印公司目前已在多处政府设施和大学安装了铜门牌和铜门把手，但科学家称应扩展到医疗设施和各公共场所。

铜具有广泛的抗微生物特性，且已安装在全球的一些医院，以阻止对抗生素具有耐药性的超级细菌的传播。初步证据显示，铜还可以摧毁新冠病毒（SARS-CoV-2）。

澳大利亚弗林德斯大学一个实验室的负责人巴特·艾克尔坎普博士在研究铜的特性，他说：“众所周知，铜具有抗微生物的特性，已用于医疗设备的抗微生物涂层。”

他说：“将之转化为更广泛的用途，比如床栏杆和扶手，似乎是非常合乎逻辑的，可能会有帮助。”

澳大利亚总理斯科特·莫里森说，正在讨论取消限制。但他重申，由于担心之后会暴发新冠疫情，解禁尚需几周的时间。

3月在美国《新英格兰医学杂志》周刊上发表的一项小型研究检测了各种物质表面的新冠病毒，结果发现，铜表面的病毒会很快变得不稳定。

打印铜门器具的澳大利亚“速度”三维打印机公司委托墨尔本的一家病毒实验室进行研究，结果表明，铜在两个小时内将病毒数量减少了96%。

悉尼大学病毒存活专家汉纳·萨西博士说：“我们已经知道铜具有抗微生物的特性，对医院的很多病原体非常有效。”

2013年在多家医院进行了一项随机对照实验，检测医院房间内的铜床栏杆、桌子和椅子扶手。镀铜表面将医院获得性感染的风险减少了一半以上。