MC4R基因、SIM1基因在从江香猪不同组织中的mRNA表达规律研究

李 俊，毛世明，周 迪，冯文武，李 平，陈大芳，龙清孟，李建伟，谢 艳，王 舍，唐明宗

（贵州省种畜禽种质测定中心，贵州 贵阳 550021）

黑素皮质激素受体-4（Meloaocrtin Recepto-4,MC4R）是下丘脑腹内侧核（ventromadial hypothalam,VMH）分泌的一种肽类物质，在哺乳动物中主要与食欲和能量稳态的调节有关，是第一个发现的与人类显性遗传性肥胖相关的靶位点[1]。而SIM1（Singleminded 1）基因是一种编码与神经发生有关的转录因子，是碱性-螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）转录因子超家族中新发现的亚家族成员之一[2]，通过影响下丘脑视上核和室旁核神经内分泌细胞在哺乳动物能量平衡调节中的作用，从而影响动物的采食行为，可导致食欲过盛、肥胖和体重增加[3]。相关研究发现，SIM1+/-和SIM1-/-小鼠食量增加，比同窝正常小鼠肥胖，且催产素（Oxytocin）和黑素皮质激素（MC4R）在下丘脑内的表达量显著降低[4]；由此推测，SIM1基因可能参与瘦素—黑素皮质激素—催产素这一调控途径，进而导致肥胖[5]。本研究拟从mRNA水平，研究MC4R基因和SIM1基因在从江香猪不同组织中的表达差异，为进一步探索MC4R基因和SIM1基因的遗传效应和肉质调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验时间与地点 试验于2018年3月至2019年6月在贵州省贵阳市乌当区羊昌镇绿生源香猪生态福利养殖场和中心实验室进行。

1.1.2 试验动物 试验对象选取8月龄从江香猪2头，采自贵阳市乌当区绿生源畜牧科技公司香猪生态福利养殖场；取其脂肪、脾脏、心脏、肺、胃、肾脏、小肠、背肌、肝脏9种组织样，用生理盐水或DEPC水冲洗后，再用锡箔纸包好立即放入液氮速冻，然后转入-80℃保存。

1.1.3 主要试剂和仪器 Trizol总RNA抽提试剂盒、荧光染料UltraSYBR Mixture SYBR GreenⅠ、异丙醇、DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水购于北京鼎国生物工程技术有限公司；M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒、DL 2 000 DNA Marker购自上海生工生物工程技术服务有限公司；去离子水、无水乙醇、TAE缓冲液等试剂实验室自备。荧光定量PCR仪（CFX96），凝胶成相系统（G：BOX F3），紫外分光光度计（NanoDrop-ONE），去离子纯水仪（Milli-Q Intergral 3），微量移液器（eppendorf）等。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取 用Trizol总RNA抽提试剂盒提取RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统照相保存，并用紫外分光光度计测量每个RNA样品浓度3次，取其平均值，用ddH2O将所有DNA样品调至100 ng/μL，-20 ℃保存备用。

1.2.2 cDNA第一链合成 本试验中第一链cDNA合成参照上海生工生物工程技术服务有限公司MMuLV第一链cDNA合成试剂盒说明进行操作，逆转录产物可直接用于PCR反应或-80℃保存。

1.2.3 引物设计与PCR扩增 参照GenBank上公布的猪MC4R基因mRNA序列（登录号：DQ482582.1）、SIM1基因mRNA序列（登录号：NM_001172585.2）、GAPDH内参基因mRNA序列（登录号：KJ786424.1）为模板，按照目的片段横跨2个外显子的原则，运用NCBI中的Primer-BLAST设计引物，委托赛默飞世尔科技（中国）有限公司合成，引物序列及扩增条件见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物信息

1.2.4 PCR反应体系及条件 采用20 μL PCR反应体系，即 cDNA 模板 1 μL，2×2×UltraSYBR Mixture 10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，RNase-Free water 8 μL。PCR反应条件为：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，退火30 s（退火温度见表1），72℃延伸32 s，共34个循环；溶解曲线分析：95℃ 30 s，60℃ 1 min，95℃15 s，60 ℃ 15 s。

1.2.5 数据处理 采用SPSS 18.0软件单因素方差分析对数据进行统计分析，利用Excel对数据结果进行作图。目的基因相对表达量采用2-△△Ct方法计算，计算公式如下：目的基因相对表达量=2-△△Ct。其中△△Ct=（处理组目的基因Ct值-处理组内参基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值）。

2 结果与分析

2.1 PCR产物特异性及扩增效率分析

对内参基因及目的基因进行荧光定量检测，观察其扩增结果。GAPDH基因、MC4R基因和SIM1基因溶解曲线均为单峰，说明所设计引物特异性良好，无引物二聚体及非特异性扩增产物出现，满足下一步试验要求。从扩增动力学曲线可以看出，3个基因扩增曲线均呈“S”形、拐点清晰、基线平缓且无上扬趋势，说明这3个基因的动力学线性整体平行性较好。由3个基因的标准曲线可见，其扩增效率E在1左右，相关系数R2大于0.990，可认为GAPDH基因、MC4R基因、SIM1基因3个基因扩增效率基本相同，可用于2-△△Ct相对定量分析。

2.2 表达差异分析

本试验通过对8月龄从江香猪不同组织进行荧光定量PCR，以脂肪中的mRNA表达量作为对照，结果发现MC4R基因和SIM1基因mRNA在从江香猪不同组织中均有表达差异（表2）。

表2 不同组织间的mRNA表达量

由表2可知，对于MC4R基因，mRNA在从江香猪脾脏组织中相对表达量最高，为脂肪表达量的1.54倍；其他组织依次为小肠、脂肪、肝脏、肺、胃、心脏、肾脏、背肌，其相对表达量分别为脂肪表达量的1.21、1.00、0.22、0.17、0.10、0.08、0.04、0.02 倍。经过SPSS 18.0统计分析，从江香猪脾脏、小肠、脂肪组织之间mRNA相对表达量差异不显著（P>0.05），但与其他组织相对表达量均达到差异显著水平（P<0.05）；而肝脏、肺、胃、心脏、肾脏、背肌组织之间mRNA相对表达量差异不显著（P>0.05）。

由表2可知，对于SIM1基因，mRNA在从江香猪脾脏组织中相对表达量最高，为脂肪表达量的2.23倍；其他组织依次为肾脏、脂肪、肝脏、小肠、胃、肺、心脏、背肌，其相对表达量分别为脂肪表达量的2.15、1.00、0.60、0.56、0.14、0.08、0.04、0.03 倍。经过SPSS 18.0统计分析，从江香猪脾脏、肾脏、脂肪组织之间mRNA相对表达量差异不显著（P>0.05），但与其他组织相对表达量均达到差异显著水平（P<0.05）；而肝脏、小肠、胃、肺、心脏、背肌组织之间mRNA相对表达量差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

3.1 MC4R基因表达规律

黑素皮质激素受-4作为G-蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors,GPCRs）超家族的组成成员之一，属于含7个跨膜区的G蛋白偶联受体，在哺乳动物的采食量、体重和维持能量稳态等方面起着重要的调控作用，它能够通过多条信号通路调节采食和能量代谢[6]。Huszar等[7]利用基因敲除的方法首次证明了MC4R在能量平衡中的关键作用；而在猪的调查研究中发现，敲除MC4R基因的小型猪表现出高厌食症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、脂质代谢紊乱，并且肝脏积聚了大量脂肪[8]。张子军等[9]对山羊的研究发现，MC4R基因在山羊心脏、肝脏等10种组织中均有表达，并在肾脏组织中的表达量最高，大肠和小肠组织中的表达量最低。黄萌等[10]研究中国西门塔尔牛发现，MC4R基因在睾丸、小肠、心脏、胰腺、淋巴、肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、肌肉和脂肪组织中均有不同程度的表达。王婕等[11]发现MC4R基因在北京鸭脑组织中表达最高，脾脏、心脏、腿肌、腹脂、肾脏次之，而在肝脏和肺脏中表达量最低。本研究发现，MC4R基因mRNA在从江香猪9种组织中均有表达，但表达存在差异，在脾脏组织中相对表达量最高，其他组织依次为小肠、脂肪、肝脏、肺、胃、心脏、肾脏、背肌。

3.2 SIM1基因表达规律

SIM1基因控制下丘脑内多种主要神经细胞形态最终阶段的分化，在哺乳动物中枢神经系统（尤其是下丘脑-垂体轴的视旁核细胞）和肾脏高水平表达，影响下丘脑内视前核和室旁核细胞的发育和形成，对食欲调节起决定作用[12]。Dahmane等[13]利用原位杂交技术35S标记探针，发现在16周胎儿内SIM1基因mRNA主要表达在中枢神经系统，在面部、头骨、下颌和脊椎内也有适量表达。而Yamaki等[14]发现SIM1基因mRNA主要表达在小鼠间脑区，Ema等[15]发现在肌肉和肺脏也有少量表达。陈哲[16]研究发现，SIM1蛋白在脑和下丘脑表达量最高，在睾丸的表达量次之，在肝脏、皮脂和甲状腺表达量较高，在肌肉表达量最低，结果提示SIM1基因在神经细胞发育、脂肪代谢和性腺发育过程都可能起到重要作用。本研究发现，SIM1基因mRNA在从江香猪9种组织中均有表达，但表达存在差异，在脾脏组织中相对表达量最高，其他组织依次为肾脏、脂肪、肝脏、小肠、胃、肺、心脏、背肌。

4 结论

本研究采用荧光定量PCR技术检测MC4R基因和SIM1基因mRNA在从江香猪不同组织中的表达规律，结果表明，MC4R基因和SIM1基因在所检测的从江香猪9种组织中均有表达，但在不同组织存在一定表达差异，均在脾脏中相对表达量最高，在背肌中最低，说明MC4R基因和SIM1基因在不同组织中参与调控能量代谢，但造成这种差异表达的原因还需进一步的深入研究。

联合国秘书长发出团结抗疫疾呼—“新冠疫情是二战以来最大挑战”

【英国广播公司网站3月31日报道】题：联合国秘书长称新冠疫情是“二战以来最大的挑战”

联合国秘书长安东尼奥·古特雷斯警告说，目前这场新冠疫情是二战以来世界面临的最大挑战。

他说，它可能会引发一场“近代历史上无可比拟的”衰退。

古特雷斯是在联合国发布有关新冠疫情可能造成的社会经济影响的报告时发表上述讲话的。

目前全球确诊病例超过85万，死亡人数超过4.1万。

古特雷斯在纽约联合国总部说：“新冠肺炎正在攻击社会的核心，夺走人们的生命和生计。”

古特雷斯说：“世界现在需要的是团结。新冠疫情是自联合国成立以来我们共同面临的最大考验。”

联合国秘书长呼吁“立即采取协调一致的卫生应对措施，以阻止病毒的传播，消灭这场疫情”。

古特雷斯敦促工业化国家帮助那些欠发达国家，否则可能“面对疾病像野火一样蔓延的噩梦”。

联合国的报告估计，此次疫情可能在全球造成多达2 500万个工作岗位流失。报告还预测全球外国直接投资量将面临最高40%的“下行压力”。

【德国电视一台网站3月31日报道】题：“二战以来最大挑战”

联合国估计，新冠疫情使世界面临二战以来最大挑战。联合国秘书长古特雷斯在一场视频会议上说，疫情将带来一场“近期不曾有过的”经济衰退。

他对国际社会的行动感到失望。我们正在朝正确的方向缓慢移动，但如果想打败病毒，我们必须加快速度并且做更多事情。”他说，应对危机的程度必须与危机本身的规模相称—各国和国际社会应在世界卫生组织领导下进行协调且全面应对。

古特雷斯说，不仅要遏制病毒，还要共同应对疫情带来的经济后果。对发达国家来说，这更容易。它们必须帮助欠发达国家，支持后者的医疗系统应对新冠疫情。联合国正在与几个伙伴合作成立一个专门的基金，帮助较贫穷国家应对经济冲击。

古特雷斯谈到了一个选择：有朝一日，危机结束，人们是想回到和从前一样的世界，还是果断解决掉使世界容易遭受此类危机的事情？从危机中复苏也应促成更公平、更环保的经济。

【德新社纽约3月31日电】联合国秘书长古特雷斯周二表示，世界在协同抗击新冠病毒方面正渐渐落后。与此同时，他启动了一项计划，以应对此次疫情造成的社会经济影响。

联合国秘书长在视频记者会上说：“我们距离在全球范围内有效抗击新冠疫情并解决其对全球经济和全球社会造成的负面影响这个目标仍然非常遥远。”

古特雷斯还说：“我们远没有制定一个帮助发展中国家的全球一揽子方案。动用的大部分资金都是发达国家用来支持它们自己经济的。”

他说，应该通过扩大国际货币基金组织的能力来增加穷国可以获得的资源，必须把重点放在受影响最深的人身上，包括处于战火中的国家的妇女和人民。

（转自 参考消息[N]，2020-04-02）