山西地方猪种肉质相关基因相对表达量比较分析

孟冬霞，马政禹，曹日亮

（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032；2.山西农业大学，山西 晋中 030801）

肉质是一个综合经济性状，受遗传、生理、营养、饲养管理条件等诸多因素的影响，其中猪品种的遗传特性对猪肉品质起决定性作用[1]。多年的研究结果表明，肉的化学组成、生理变化和食用品质等均受到基因表达的调控，基因对肉品质的影响主要表现在以下几个方面：肉色、最终pH、持水性、肌内脂肪。己糖激酶同工酶（HK）基因、ATP合成酶（ATP5B）基因及磷酸果糖激酶（PFK）基因与pH、肉色、滴水损失有关，心脏脂肪酸结合蛋白（H-FABP）主要影响肌内脂肪含量，MyoD基因族和钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）主要调控肌纤维的生长和转化，脂蛋白脂肪酶（LPL）基因主要影响脂肪代谢、沉积，与背肌长、平均背膘厚显著相关[2-4]。山西黑猪、晋阳白猪是山西主要2个地方猪种。本项目在对山西黑猪和晋阳白猪肉色、pH、系水力、肌内脂肪含量、氨基酸含量、脂肪酸含量、胆固醇含量等肉质特性分析的基础上，进一步对 CAST、H-FABP、ATP5B、LPL、MyoG、PFK、HK等7个肉质相关基因表达量进行比较分析，为系统开展山西地方猪种肉质性状遗传控制奠定基础，同时也为山西地方猪种的推广应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

2016年6—9月在山西大同地区某猪场进行饲养试验，在大同生猪定点屠宰场进行屠宰，屠宰时迅速取背最长肌组织样品，装入冻存管，编号并及时投入液氮中迅速冷冻，然后将所有样品转到-70℃低温冰箱中保存。

1.2 试验动物与分组

选择体重30 kg左右的山西黑猪、晋阳白猪各30头，按品种分为2组，即山西黑猪组和晋阳白猪组，每组5个重复，每个重复6头猪，组间平均体重差异不显著。预试期10 d，进行驱虫和健胃后，开始正式试验。饲喂相同饲粮，猪瘟、口蹄疫、蓝耳病等免疫程序按常规进行。体重达110 kg左右时，饲养试验结束。

1.3 测定指标

饲养试验结束后，进行屠宰，每个品种随机抽选6头猪进行屠宰取样，测定CAST、H-FABP、ATP5B、LPL、MyoG、PFK、HK 等 7个肉质相关基因，并进行比较分析。

1.4 主要试剂、仪器

Trizol试剂盒、cDNA合成试剂盒、核酸染色剂、琼脂糖，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；SW-CJ-1D洁净工作台，江苏苏洁净设备厂生产；HC－2518R高速冷冻离心机，安徽中科中佳仪器有限公司生产；H6－1微型电泳槽，上海精益有机玻璃制品仪器厂生产；FR980凝胶成像系统，上海复日科技有限公司生产；PCR反应扩增仪，BIO公司生产；TU－1901紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司生产；移液器（100～1 000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL），加拿大 BBI公司生产；LightCycler480 Software Setup，Roche罗氏生产。

1.5 功能基因检测方法

1.5.1 总RNA提取、cDNA合成 应用Trizol试剂盒提取试验猪背最长肌总RNA，用1.5%琼脂糖凝胶电泳和核酸仪检测验证RNA的完整性。注意：整个操作要戴口罩及一次性干净手套，并尽可能在低温下操作；使用cDNA合成试剂盒合成cDNA。

1.5.2 引物设计 应用Primer Premier 5.0软件，针对7个目的基因进行引物设计，引物序列和扩增片段信息见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列和扩增片段信息

1.5.3 PCR扩增 将cDNA样品稀释8倍作为模板进行实时荧光定量PCR检测。PCR反应体系20 μL：SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性7 s，57℃退火10 s，72℃延伸15 s，共45个循环。完成上述步骤后，把加好样品的96/384孔细胞培养板放在LightCycler480 Software Setup（Roche罗氏）中进行反应。

1.5.4 猪肉样品中功能基因相对表达量的检测CAST、H-FABP、ATP5B、LPL、MyoG、PFK、HK 等 7 个基因相对表达量的检测均是由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.6 数据的统计分析

基因相对表达量用2－△△Ct法计算。数据采用SPSS 18.0中的ANOVA程序进行方差分析和邓肯氏（Duncan）多重比较。试验结果以均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 猪肉样品中RNA检验结果

从猪背最长肌组织样品中提取RNA，总RNA提取浓度在 200～1 000 ng/μL，OD260/OD280比值在1.8～2.0之间，表明总RNA纯度良好，可以满足试验要求。2个品种的猪肉样品均扩增出特异性条带。

2.2 猪肉样品7个基因相对表达量测定结果

猪肉样品7个基因相对表达量的测定结果见表2。由表2可知，山西黑猪HK、MyoG基因的相对表达量极显著高于晋阳白猪（P<0.01）；山西黑猪HFABP、CAST基因的相对表达量均显著高于晋阳白猪（P<0.05）；山西黑猪 ATP5B、PFK、LPL基因的相对表达量均高于晋阳白猪，但差异不显著（P>0.05）。

表2 猪肉样品7个基因相对表达量测定结果

3 讨论

猪心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因是近年发现的影响猪肉质的主要候选基因[5]，主要在心肌和骨骼肌细胞中表达，对长链脂肪酸稳定的吸收和代谢有关键作用[6-7]。H-FABP基因的多态性显著影响IMF（肌内脂肪）含量和背膘厚[8]。IMF是嫩度的一个主要决定因素。Patrica等研究发现，肉的嫩度随IMF的含量增加而改善，是因为肌纤维内部和肌束之间的脂肪组织和结缔组织呈交叉状分布，脂肪含量增多可能会降低结缔组织的物理强度，最终使肉的嫩度得到改善。CAST活性与肉的嫩度具有高相关性，与肌肉剪切力的平均表达高达28.9%，可作为肉质嫩度性状的候选基因[9]。本试验中山西黑猪H-FABP、CAST基因的相对表达量均显著高于晋阳白猪（P<0.05），与文献[10]中山西黑猪的肌内脂肪含量显著高于晋阳白猪试验结果一致。

肌纤维是构成肌肉的基本单位，肌纤维直径越细，肉质越嫩；肌纤维比例越大，肉质也越细嫩。肌纤维的生长和转化受到MyoD基因族和钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）的调控[3，11-12]。MyoD 基因家族包括Myf-3、肌细胞生成素 Myf-4（MyoG）、Myf-5 及人体Myf-6基因。MyoG主要在骨骼肌中表达，是骨骼肌生长发育的抑制因子，与猪的生长性能和胴体特性相关，MyoG的突变能改变肌肉肌纤维的数目。脂蛋白脂肪酶（LPL）是动物机体组织脂肪沉积过程中的关键酶，能够把血液中极低密度脂蛋白所携带的甘油三酯和乳糜微粒分解成甘油和脂肪酸，为脂肪组织合成甘油三酯提供的原料。王刚等对莱芜猪和鲁莱猪的研究表明LPL是肌内脂肪沉积的重要参与者，其编码基因的表达具有明显的体重发育特征，并对肌内脂肪的沉积具有一定程度影响[13]；本试验中山西黑猪MyoG基因表达量极显著高于晋阳白猪（P<0.01），山西黑猪LPL基因的表达量与晋阳白猪差异不显著（P>0.05）。文献[10]中由于经费原因，没有测量山西黑猪和晋阳白猪的肌纤维直径、背肌长及平均背膘厚，条件允许时将进一步进行检测分析。

ATP合成酶基因与动物的能量代谢、骨骼肌的形成、肌内脂肪含量都有着密切关系[14]，通过对肌肉中糖代谢的调节，ATP5B基因在最终肉质性状（pH、肉色、滴水损失）中起着关键控制作用[15]；HK基因是糖酵解途径的第一个酶，也是糖酵解途径的限速酶，对宰后猪肉品质形成具有重要影响[16]。生猪屠宰后，肌肉pH从7.0降至5.5左右，肌肉首先变硬变粗，随后变嫩，经过一系列变化过程，最终形成具有一定色泽、质地、风味等品质特性的食用肉。研究表明，不同品种猪宰后其肉品质具有一定差异性，且宰后无氧糖酵解速度和程度对肉品质形成具有重要影响，无氧糖酵解速度越快，越易产生PSE肉[17]。ATP5B、PFK和HK基因均与pH、肉色、滴水损失有关。由试验可知，山西黑猪HK基因的相对表达量极显著高于晋阳白猪，山西黑猪ATP5B、PFK基因的相对表达量与晋阳白猪差异不显著（P>0.05），与文献[10]中 pH、L 值（亮度）、b值（黄度）、系水力试验结果基本一致。