KIF21B在肝细胞癌中的表达及临床意义的研究

董保龙，何 雨，陈世勇，吴 彪，高 鹏,3，杨晓军,3

1.甘肃省人民医院普外二科，甘肃 兰州 730000；

2.甘肃省外科肿瘤分子诊断与精准治疗重点实验室，甘肃 兰州 730000；

3.兰州大学人民临床医学院，甘肃 兰州 730000

2018年全球癌症统计数据显示，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）发病率和死亡率分别位居癌症的第6位和第3位［1］。在中国其发病率和死亡率分别位居癌症的第4位和第3位［2］。尽管近年来对HCC的治疗有了很大发展，包括手术、射频/微波消融、介入、放射性粒子植入等，但HCC患者5年生存率依然不到7%［3］。研究表明，癌基因和抑癌基因等肿瘤相关基因在HCC的发生、发展过程中发挥重要作用，基因治疗为HCC提供了一种新的治疗选择［4］。

近年研究发现，肿瘤细胞中某些微管相关蛋白的异常表达会导致微管动态系统的失衡，对肿瘤的发生、发展起重要的作用［5-6］。驱动蛋白家族（kinesin superfamily，KIF）是一类调控微管运动的分子马达，参与细胞运动、有丝分裂、细胞器运输、细胞骨架重塑及细胞癌变过程［6］。既往研究显示，KIF（KIF3B、KIF18A、KIF14、KIF4A、KIF20A、KIF23）的异常表达与HCC的发生、发展及预后密切相关［6-10］。KIF21B作为经典的驱动蛋白分子，多见于神经元细胞和免疫细胞中，其异常表达与神经退行性病变密切相关［11］。然而，目前尚未见有研究报道KIF21B在肿瘤中的表达及其作用。因此，本研究通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库分析KIF21B的表达差异及其与临床病理学特征的关系；应用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）检测HCC细胞及正常肝细胞中KIF21B的表达差异；应用免疫组织化学法进一步验证KIF21B在HCC中的表达及其临床意义。

1 资料和方法

1.1 标本收集

收集甘肃省人民医院2014年3月—2018年6月行HCC手术切除的116例患者存档蜡块。所有患者均未接受化放疗或射频消融，具有完整的临床、病理学和随访资料。其中男性67例，女性49例；年龄27～74岁，中位年龄57岁，≥57岁60例，＜57岁56例；肿瘤直径≥5 cm 51例，＜5 cm 65例；乙肝病毒表面抗原（hepatitis virus B surface antigen，HBsAg）阴性48例，HBsAg阳性68例；合并肝硬化43例，无肝硬化73例；血清中甲胎蛋白（alpha fetal protein，AFP）＞400 ng/mL 64例，≤400 ng/mL 52例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期63例，Ⅲ～Ⅳ期53例；合并有血管侵犯57例，无血管侵犯59例；总生存期（overall survival，OS）是指末次随访时间或死亡时间；无病生存期（disease-free survival，DFS）是指疾病复发或由于疾病进展导致患者死亡的时间。本研究通过甘肃省人民医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

免疫组织化学KIF21B抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗和二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色剂购自武汉塞维尔生物科技有限公司；人HCC细胞系Huh-7和SK-Hep-1及正常肝细胞HL-7702购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。DMEM和RPMI-1640细胞培养液购自美国Gibco公司，TRIzol试剂购自上海普飞生物技术有限公司，RTFQ-PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；cDNA反转录试剂盒购自美国Promega公司；KIF21B和GADPH基因引物由上海吉凯基因化学技术有限公司设计合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学法分析

根据试剂盒操作步骤如下：取4 μm厚石蜡包埋组织切片，二甲苯脱腊、无水乙醇（100%、85%、75%）水化；在柠檬酸抗原修复缓冲液（pH=6.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复；切片放入3%双氧水溶液，室温避光温育25 min，阻断内源性过氧化物酶；兔抗人KIF21B抗体（1∶100）4 ℃温育过夜；洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶200），于室温下温育50 min后加入DAB显色、苏木精复染、脱水、透明和中性树脂封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3.2 免疫组织化学结果分析

免疫组织化学检测结果判断标准：细胞质内出现黄色颗粒染色判定为阳性，每张切片在高倍镜下取3个不同视野，并各计数100个细胞。染色阳性细胞比例计分：阳性细胞比例≤10%，计0分；10%＜阳性细胞比例≤25%，计1分；25%＜阳性细胞比例≤50%，计2分；阳性细胞比例＞50%，计3分。细胞染色强度强弱：无明显染色计0分，染色浅黄色计1分，染色棕黄色计2分，染色棕褐色计3分。染色阳性细胞比例计分与染色强度强弱相乘即为免疫组织化学染色强度计分，0～1分为（-），2～3分为（+），3～4分为（++），＞4分为（+++）。计分≥2分为阳性，计分≤1分为阴性［12］。

1.3.3 RTFQ-PCR检测KIF21B在HCC细胞系及正常肝细胞系中的基因表达

SK-Hep-1和HL-7702培养于含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RPMI-1640培养液中，Huh-7培养于含有10%FBS的DMEM培养液中。将所有细胞置于培养箱中在37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下进行培养。取对数期的细胞进行实验。KIF21B引物序列：顺义链为5’-GGATGCCACAGATGAGTT-3’，反义链为5’-TGTCCCGTAACCAAGTTC-3’。GA PD H引物序列：顺义链为5’-T G AC T T C AACAGCGACACCCA-3’，反义链为5’-CACCC TGTTGCTGTAGCCAAA-3’。TRIzol法提取细胞总RNA并反转录为cDNA后进行后续RTFQ-PCR，反应条件为：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；60 ℃，45 s；72 ℃，45 s；72 ℃，5 min；40个循环后转为4 ℃保存，共40个循环。以GAPDH为参照，在Rotor-Gene MX3000p RTFQ-PCR仪上进行；用Rotor-Gene 6.1 software分析数据，结果采用2-ΔΔCt分析法计算。

1.4 生物信息学分析

通过TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/legacyarchive/search/f）分析KIF21B在HCC组织及正常组织中的表达，选取RNAseq 及RNAseqV2的成对样本数据进行分析。TCGA数据库现存377个有可用数据的样本，其中RNAseq样本有371个，有50对有成对样本数据。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 TCGA数据库中KIF21B在HCC组织及正常组织中的表达情况

RNAseq 数据经过比对后，通过比对深度计算得到的原始表达量值，50 对HCC 组织中的KIF 21B 在HCC癌组织中的mRNA 表达丰度（659.90±74 4.95）显著高于癌旁组织（129.48±139.76，P＜0.01，图1）。

图1 HCC与正常肝组织中KIF21B表达差异Fig.1 The differential expression of KIF21B in HCC and normal tissues

2.2 目的基因表达水平与临床病理学参数的相关性

自TCGA数据库检索出377个有可用数据的样本，其中RNAseq样本有371个，368个有完整的T分期，347个有完整的病理学分期。Mann-WhitneyU检验分析显示，KIF21B表达与T分期、病理分期相关，差异有统计学意义（P＜0.01，表1～2，图2）。

表1 KIF21B表达与临床T分期之间的关系Tab.1 The relationship between KIF21B and T stage

表2 KIF21B表达与临床病理分期之间的关系Tab.2 The relationship between KIF21B and pathological stage

图2 KIF21B表达与病理分期的关系Fig.2 The correlation between KIF21B expression and pathological stage

2.3 KIF21B在HCC细胞系及正常肝细胞系中的表达差异

RTFQ-PCR检测KIF21B基因在HCC细胞系及正常肝细胞中的表达水平，结果表明，KIF21B mRNA在HCC细胞系Huh-7（ΔCt=13.64±0.062）和SK-Hep-1（ΔCt=12.82±0.190）中的表达均高于正常肝细胞HL-7702（ΔCt=16.87±0.183），差异均有统计学意义（P＜0.01，图3）。

2.4 免疫组织化学法检测结果

免疫组织化学法检测结果显示，KIF21B表达于细胞质中，棕色区域为KIF21B表达位置，蓝色区域为细胞核位置（图4），依据半定量评分将患者分为KIF21B低表达组和KIF21B高表达组。HCC组织中KIF21B低表达组42例（36.2%），高表达组74例（63.8%）；癌旁组织中KIF21B低表达组102例（87.9%），高表达组14例（12.1%），差异有统计学意义（P＜0.01）。

图3 KIF21B在HCC细胞系及肝细胞系中的差异性表达Fig.3 The differential expression of KIF21B in HCC cell lines and hepatocyte lines

图4 免疫组织化学法检测KIF21B在HCC组织及癌旁组织中的表达Fig.4 The expression of KIF21B in HCC tissues and adjacent tissues detected by immunohistochemical analysis

2.5 KIF21B表达与HCC患者临床病理学特征的关系

χ2检验分析显示，KIF21B表达与HCC患者年龄、性别、肿瘤大小、肝硬化、血清AFP水平无明显关系（P＞0.05），而与HCC患者TNM分期相关（P＜0.05），与HBsAg、血管侵犯显著相关（P＜0.01，表3）。

表3 KIF21B与HCC患者临床病理学特征之间的关系Tab.3 Correlation between KIF21B expression and clinicopathological characteristics of HCC patients

2.6 KIF21B表达与HCC患者OS和DFS的关系

KIF21B高表达者的中位OS为26个月，低表达者为40个月，差异有统计学意义（P=0.004，图5A）；KIF21B高表达者的中位DFS为21个月，低表达者为30个月，差异有统计学意义（P=0.035，图5B）。

2.7 影响HCC患者OS的危险因素

单因素分析结果显示，肿瘤大小（P=0.011）、血清AFP水平（P=0.015）及KIF21B表达（P=0.044）为影响HCC患者OS的因素（表4）；多因素分析结果显示，肿瘤大小（P=0.023）及KIF21B表达（P=0.010）为影响HCC患者OS的独立危险因素（表5）。

图5 KIF21B表达与HCC患者OS和DFS的关系Fig.5 The correlation between KIF21B expression and OS or DFS in HCC patients

表4 单因素分析HCC患者OS相关危险因素Tab.4 Univariate analysis of OS in 116 HCC patients

表5 多因素分析HCC患者OS相关危险因素Tab.5 Multivariate analysis of OS in 116 HCC patients

2.8 影响HCC患者DFS的危险因素

单因素结果分析显示，年龄（P=0.024）和KIF21B表达（P=0.024）为影响HCC患者DFS的因素（表6）；多因素结果分析显示，KIF21B表达（P=0.036）为影响HCC患者DFS的独立危险因素（表7）。

表6 单因素分析HCC患者DFS相关危险因素Tab.6 Univariate analysis of DFS in 116 HCC patients

表7 多因素分析HCC患者DFS相关危险因素Tab.7 Multivariate analysis of DFS in 116 HCC patients

3 讨 论

KIF在细胞内负责沿着微管，向其正极运送不同的分子，是细胞内小泡、细胞器、蛋白复合物和RNA等转运的重要分子之一［13-14］。驱动蛋白与其他的分子马达一起，以微管等细胞骨架为依托，将不同的分子运送到指定的细胞内位置，对维持细胞的基本功能具有极其重要的作用［5］。

KIF21B作为KIF中的成员之一，与强直性脊柱炎、炎性肠病、多发性硬化症、糖尿病密切相关［15-18］。目前关于KIF21B的功能及相关机制研究大多集中在神经退行性疾病上。Ghiretti等［19］的研究证实，KIF21B能够作为树突中活性依赖性转运和微管动力的分子调节子。然而，KIF21B在肿瘤中的研究鲜见报道。但其家族成员（KIF3B、KIF18A、KIF14、KIF4A、KIF20A、KIF23）在肿瘤中已被广泛研究，且与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。最近的研究还发现，KIF3B［6］、KIF18A［20］和KIF20A［21］在人HCC和HCC组织中高表达，其高表达与HCC分级和不良预后有关。

本研究首先通过TCGA数据库发现KIF21B在HCC组织中的表达高于癌旁组织，并应用免疫组织化学法分析发现KIF21B在HCC组织及癌旁组织中的表达差异，这与前期TCGA数据库结果一致。利用HCC组织样本检测KIF21B的表达发现，KIF21B高表达与合并乙肝感染、TNM分期和微血管侵犯密切相关（P＜0.05）；生存分析显示，KIF21B高表达的HCC患者生存时间短且易复发；COX分析显示，KIF21B表达状态可作为预测HCC患者预后的独立危险因素。大量研究表明，KIF参与了多种肿瘤进程，发挥促癌或抑癌作用，其表达水平的变化与很多肿瘤的发生、发展有直接关联［22-24］。基于KIF3B、KIF18A和KIF20A在HCC的报道，本研究推测KIF21B高表达促进HCC患者的进展，也是术后患者OS和DFS预后的独立危险因素。

综上，本研究首次报道了KIF21B表达在HCC组织中明显增加，且与预后不良密切相关，为确立以KIF21B为靶点的肝癌治疗策略提供了一定的理论依据。然而，本研究也存在一些的不足之处，明确KIF21B参与HCC发生、发展的相关机制还值得深入研究。