Calreticulin在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

复旦大学附属中山医院病理科，上海 200032

淋巴瘤是最常见的淋巴造血系统恶性肿瘤，发病率逐年升高，在中国常见恶性肿瘤死亡原因中居第10位［1］，其中B细胞型非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）发病占淋巴瘤的90%以上，而NHL中最常见的亚型为弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）。中国的DLBCL发病率占所有B细胞NHL的40%以上［2］，是成人最常见的B细胞NHL。DLBCL分为生发中心B细胞样（germinal center B-cell，GCB）型和非生发中心B细胞样（non-GCB）型。化疗联合利妥昔单抗可以改善临床结局［3］。然而，1/3的患者会逐渐耐药，变为难治性，对以往治疗药物甚至二线治疗或基于免疫治疗的三线治疗无反应［4］，这些患者预后往往较差。根据2016年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）修订版淋巴组织肿瘤分类［5］，将以往的介于Burkitt淋巴瘤与DLBCL形态之间的“灰区”淋巴瘤归为高级别B细胞淋巴瘤，其中发生MYC、BCL-2和（或）BCL-6基因重排的高级别B细胞淋巴瘤划分为新的独立类型，称为“双打击”或“三打击”高级别B细胞淋巴瘤（double/triple hit lymphoma，DHL/THL），其发生率为6%～13%［6］。

钙网蛋白（calreticulin）相对分子质量为46×103，是内质网内主要的钙结合蛋白之一［7］，其参与多个重要的细胞过程，主要包括钙离子平衡调节、蛋白质折叠加工、基因表达调控、血管生成、细胞黏附、抗原呈递、自身免疫等［8-9］，主要分布在细胞质及细胞膜中。研究表明，calreticulin在多种恶性肿瘤中均有表达，如胃腺癌［10］、尿路上皮癌［11］、鳞状细胞癌［12］、肺腺癌［13］、前列腺癌［14］等，在肿瘤中发挥促进肿瘤生长、转移及侵袭等作用。但其在淋巴瘤中尤其是B细胞NHL中表达的临床意义仍不明确。为了评估calreticulin的表达对DLBCL患者预后的影响，本研究采用免疫组织化学技术检测DLBCL肿瘤组织中calreticulin的表达情况，同时应用荧光原位杂交（fluorescencein situhybridization，FISH）技术检测肿瘤组织中MYC、BCL-2、BCL-6基因的重排情况，旨在为临床评估预后提供参考。

1 资料和方法

1.1 病例资料

收集2015—2018年于复旦大学附属中山医院确诊且临床资料完整的143例DLBCL患者作为研究对象。标本经4%的甲醛溶液固定，之后进行脱水及石蜡包埋，切片后进行H-E染色。根据H-E切片，每例选定1个典型且均一的取样位点制作组织芯片。应用免疫组织化学技术检测肿瘤组织中calreticulin的表达情况，同时应用FISH技术检测肿瘤组织中MYC、BCL-2、BCL-6基因的重排情况，进一步结合临床资料进行回顾性分析。由2名独立的经验丰富的病理科医师读片证实H-E染色、免疫组织化学染色及FISH结果。所有DLBCL均依据WHO 2008年诊断标准和2016年修订标准［5］确诊，并应用Hans法则分为GCB型和non-GCB型。本研究经复旦大学附属中山医院医学伦理委员会批准（B2018-073R），所有患者和（或）家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 免疫组织化学

将制作好的组织芯片切片后，进行H-E染色及免疫组织化学染色。免疫组织化学试剂盒购自罗氏诊断产品（上海）有限公司。Calreticulin抗体购自美国Proteintech Group公司。CD20、CD3、PAX-5、BCL-6、BCL-2、CD10和Ki-67等淋巴瘤常用一抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。应用罗氏诊断产品（上海）有限公司的BenchMark XT全自动免疫组织化学染色仪进行免疫组织化学染色。结果判定：calreticulin为细胞质和细胞膜着色，＞75%的细胞无着色为0分，＞75%的细胞浅黄着色为1分，＞75%的细胞黄色着色为2分，＞75%的细胞棕黄着色为3分。定义0～1分为calreticulin阴性表达，定义2～3分为calreticulin阳性表达。

1.3 FISH

石蜡切片脱蜡后放入82 ℃蒸馏水中预处理25～30 min，之后于37 ℃胃蛋白酶（美国Sigma公司）溶液中消化后梯度乙醇脱水、风干。所用探针均购自美国Abbott公司（Vysis BCL-2 Break Apart FISH Probe Kit、Vysis BCL-6 Break Apart FISH Probe Kit、Vysis MYC Break Apart FISH Probe Kit）。应用美国Abbott公司的Thermo Brite杂交仪按探针说明书提供的方法进行操作。在日本Olympus公司BX5l型荧光显微镜下观察，根据分离探针属性，红绿信号分离为阳性信号。结果判定：正常细胞显示2个红色、2个绿色信号，当红绿信号之间分离超过2个点宽度时判为异常细胞，异常细胞比例超过阈值，就判断患者为基因重排阳性。每个标本由3名实验员分别计数，取其平均值。本实验室MYC、BCL-2、BCL-6基因重排阳性细胞阈值均为15%。本课题研究对象为非DHL/THL的DLBCL病例。

1.4 随访

对所有患者随访5～57个月，随访以门诊或电话方式进行，随访内容包括患者生活质量、一般情况、近期复查情况等。终点事件为患者因DLBCL死亡。观察记录每例随访患者的生存时间，总生存期（overall survival，OS）指自病理学确诊至因任何原因死亡的时间。

1.5 统计学处理

数据均采用SPSS 19.0软件进行分析，DLBCL中calreticulin的表达与临床病理学参数间的关系行Pearsonχ2检验，若理论频数1≤T＜5，采用χ2检验的连续校正公式，若理论频数T＜1，采用χ2检验的Fisher精确概率法。生存分析采用Kaplan-Meier分析。应用COX比例风险模型分析影响DLBCL患者预后的因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Calreticulin在DLBCL患者肿瘤组织中的表达

Calreticulin的表达部位为细胞质和细胞膜。Calreticulin代表性免疫组织化学检测结果见图1。143例DLBCL患者中，calreticulin不表达的病例为12例（8.4%），1分病例40例（28.0%），2分病例43例（30.1%），3分病例48例（33.6%）。本研究0～1分定义为calreticulin阴性，2～3分定义为calreticulin阳性，143例DLBCL患者中，calreticulin阳性表达者92例，阳性表达率为64.3%。

2.2 Calreticulin表达水平与DLBCL病例临床病理学特征的关系

Calreticulin表达情况与DLBCL患者临床病理学特征的关系见表1。经χ2检验发现，Ann Arbor分期Ⅰ、Ⅱ期的病例在calreticulin阳性组所占比例（38.0%）高于calreticulin阴性组（17.6%）（P=0.011）。国际预后指数（international prognostic index，IPI）评分0～1分的病例在calreticulin阳性组中所占比例（34.8%）高于calreticulin阴性组（11.8%）（P=0.013）。DLBCL患者calreticulin表达阳性组及calreticulin表达阴性组的年龄、性别、Hans分型、MYC重排、BCL-2重排及BCL-6重排等比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 DLBCL患者肿瘤组织中calreticulin的代表性免疫组织化学染色Fig.1 Representative immunohistochemical staining of calreticulin in tumor tissues of DLBCL patients

2.3 DLBCL组织中calreticulin表达与生存期的关系

对本研究143例DLBCL患者随访5～57个月。在随访结束时，calreticulin阳性组92例患者中，24例因疾病死亡，68例至随访结束仍生存；Calreticulin阴性组51例患者中，5例因疾病死亡，46例至随访结束仍生存。Calreticulin阳性组死亡患者的比例（26.1%）明显高于calreticulin阴性组（9.8%），差异有统计学意义（χ2=5.381，P=0.020）。Kaplan-Meier生存曲线见图2，calreticulin阳性表达组较阴性表达组生存期短（χ2=5.285，P=0.022）。应用Hans法则将所有

DLBCL患者分为GCB型和non-GCB型后发现，在GCB亚型中，calreticulin阳性表达患者较阴性表达患者OS显著缩短（P=0.023），而在non-GCB亚型中，calreticulin阳性表达患者OS与阴性表达患者差异无统计学意义（P=0.307，图3）。

表1 Calreticulin表达与DLBCL患者临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between calreticulin expression and clinicopathological characteristics of patients with DLBCL

图2 Calreticulin蛋白表达对DLBCL患者OS的影响Fig.2 The influences of calreticulin protein expression on the OS of DLBCL patients

2.4 影响DLBCL患者预后因素的单因素及多因素分析

单因素及多因素COX回归分析发现，年龄是否大于60岁及calreticulin表达是影响DLBCL患者预后的独立危险因素（P＜0.05，表2）。

通过对年龄、是否GCB亚型、Ann Arbor临床分期及IPI分数这些影响淋巴瘤患者预后的因素进行分层分析，发现在年龄大于60岁（HR=3.163，95% CI：1.186～8.437）、Ann Arbor分期为Ⅲ～Ⅳ期（HR=3.456，95% CI：1.296～9.215）、IPI分数3～5分（HR=4.188，95% CI：1.407～12.468）的患者中calreticulin阳性表达提示DLBCL患者预后较差（表3）。

图3 Calreticulin表达对GCB与non-GCB亚型DLBCL患者OS的影响Fig.3 The influences of calreticulin expression on the OS in patients with GCB and non-GCB subtype DLBCL

表2 影响DLBCL患者预后的单因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analyses of clinicopathologic characteristics affecting the prognosis of DLBCL patients

表3 对calreticulin表达和DLBCL患者的生存进行分层分析Tab.3 Stratified analysis for calreticulin expression and DLBCL patients’ survival

3 讨 论

DLBCL患者的预后随着治疗方案的优化已经取得了明显的改善，但仍有约1/3的患者最终死于耐药或疾病复发［15］，其耐药的具体分子机制目前尚不明确。在精准医学时代，研究影响DLBCL预后的因素有助于对不同患者制定更具有针对性的精准治疗方案。目前有研究表明，发生MYC、BCL-2和（或）BCL-6基因重排的DHL/THL预后较差，不管临床上给予任何治疗方案，其中位生存期仅2～18个月［16-17］。MYC基因定位于染色体8q24上，长期以来一直被认为是真正的癌基因。正常情况下MYC表达量很低且具有诱导正常细胞凋亡的能力，但其可能通过基因突变、基因扩增和染色体易位等机制而不受调控地过度表达，使细胞发生转化［18］，在肿瘤细胞增殖和癌细胞转移中发挥关键作用［19］。多项研究证实，在利妥昔单抗时代，发生MYC基因重排的DLBCL患者治疗反应差，容易复发及进展［20-24］。当然，也有一些研究指出，发生MYC、BCL-2重排的双打击淋巴瘤患者预后差主要是因为BCL-2重排［25］。BCL-2是抗凋亡的原癌基因，位于染色体18q21上，编码抗凋亡蛋白，可抑制肿瘤细胞凋亡，发生染色体（14；18）（q32；q21）易位后，会导致BCL-2与IGH基因融合，使BCL-2蛋白异常高表达。已知BCL-2在多种肿瘤中呈高表达，并且与耐药相关［26］。有研究［27］发现，DLBCL患者中，MYC基因易位发生率约为14%，BCL-2基因易位发生率约为21%，而BCL-6基因易位发生率约为31%。本研究中MYC、BCL-2和BCL-6基因易位发生率分别为8.4%、8.4%和25.2%，略低于文献报道的水平，可能与人群的地区差异及样本量有关。

Calreticulin是高度保守、普遍存在于哺乳动物细胞内质网腔中的钙结合蛋白，随着近年来研究的逐渐深入，发现calreticulin的生物功能不仅局限在内质网腔，而是涉及参与调节细胞凋亡、应激、钙离子平衡调节等多种生理和病理生理过程的多功能蛋白［28］。已发现calreticulin存在于除酵母以外的所有细胞当中，主要分布在细胞质及细胞膜中。目前已发现calreticulin在多种恶性肿瘤中的表达增加，且与肿瘤侵袭、淋巴结转移等呈正相关。在胰腺导管腺癌中，calreticulin以依赖MEK/ERK通路的方式上调肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭［29］。乳腺浸润性导管癌组织中的calreticulin表达较癌旁组织明显增加［30］。Calreticulin还可通过激活STAT5A通路促进食管鳞状细胞癌的转移及侵袭［12］。在膀胱尿路上皮癌中calreticulin的表达量也有所增加，calreticulin表达的下调可抑制肿瘤细胞的生长与迁移能力，而其过表达可增强细胞的迁移和附着能力［11］。在结肠癌中calreticulin呈高表达，这种高表达尤其表现在恶性程度高和分化较低的区域肿瘤细胞中［31］。在淋巴造血系统中，calreticulin的作用也越来越受到研究者的重视。有研究［32］显示，沉默calreticulin的表达后，NK/T细胞淋巴瘤细胞的增殖及侵袭能力受到抑制，提示calreticulin在肿瘤细胞增殖及侵袭中具有重要作用。另有研究［33］发现，70%～84%的骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）患者存在calreticulin基因突变，且calreticulin基因突变与JAK2和MPL突变是相互排斥的。而在其他髓系肿瘤中，如急性髓系白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征中未见calreticulin基因突变。但calreticulin基因突变与calreticulin高表达之间的关系仍有待进一步研究。

本研究的143例DLBCL患者中，calreticulin阳性表达者92例，阳性表达率为64.3%。Kaplan-Meier生存曲线显示，calreticulin阳性表达组较阴性表达组生存期短（χ2=5.285，P=0.022）。应用Hans法则将所有DLBCL患者分为GCB型和non-GCB型后发现，在GCB亚型中，calreticulin阳性表达患者较阴性表达患者O S 显著缩短（P=0.023），而在non-GCB亚型中，calreticulin阳性表达患者OS与阴性表达患者差异无统计学意义（P=0.307），在non-GCB亚型中，calreticulin阳性与阴性的患者生存差异无统计学意义可能与non-GCB亚型预后较差有关，non-GCB患者中大部分为激活B细胞样（activated B cell-like，ABC）型。多项研究显示，ABC型的DLBCL患者比GCB型患者预后差［22，34］。本研究还发现，MYC重排阳性在calreticulin阳性组中所占比例明显高于阴性组，而ABC及GCB型在BCL-2、BCL-6、MYC等基因的重排率、信号通路的活化、基因突变等方面都不尽相同，可能与calreticulin表达在non-GCB亚型中无明显差异有关，需要今后进一步的研究证实。进一步进行单因素及多因素COX回归分析发现，年龄是否大于60岁及calreticulin表达是影响DLBCL预后的独立危险因素（P＜0.05），分层分析发现，在年龄大于60岁（HR=3.163，95% CI：1.186～8.437）、Ann Arbor分期为Ⅲ～Ⅳ期（HR=3.456，95% CI：1.296～9.215）、IPI分数3～5分（HR=4.188，95%CI：1.407～12.468）的患者中calreticulin阳性表达提示DLBCL患者预后较差，提示calreticulin高表达与DLBCL的不良预后有关。综上所述，DLBCL中calreticulin阳性表达的患者生存率低，可能与肿瘤细胞增殖及侵袭能力增加有关，calreticulin的表达对DLBCL预后评估具有一定参考价值。