LncRNA LINC00152过表达在替莫唑胺诱导脑胶质瘤干细胞周期阻滞中的作用机制探讨

张良龙，安宏伟，赵立智，董 倩，高桂艳

1.沧州市人民医院神经外科，河北 沧州 061000；

2.德州市陵城区中医院神经外科，山东 德州 253500

脑胶质瘤是常见的颅内原发性恶性肿瘤，患者的中位生存期仅为15～19个月［1-2］。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）属第二代烷化剂类抗肿瘤药物，不经过肝脏代谢、易于通过血脑屏障进入脑脊液，能引起脑胶质瘤细胞周期阻滞和凋亡，疗效确切［3］。但TMZ单独使用对恶性脑胶质瘤的有效率仍不足50%，这是临床治疗所面临的严重挑战。LINC00152是异常表达于肝癌、胃癌及结肠癌等恶性肿瘤中的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）之一，参与细胞增殖、迁移及转移等生物学行为［4-6］。最新研究显示，LINC00152与脑胶质瘤患者不良预后相关，下调LINC00152基因表达可抑制脑胶质瘤细胞的体内生长［7］。还有研究显示，上调LINC00152可促进胶质瘤细胞侵袭［8］，提示LINC00152参与胶质瘤细胞的恶性生物学行为。脑胶质瘤干细胞（glioblastoma stem cell，GSC）是存在于脑胶质瘤中的一类细胞，具有自我更新迅速、无限增殖及多向分化潜能［9］。并且GSC与神经干细胞类似，在脑胶质瘤耐药和复发中起到关键性作用［10］，但LINC00152与TMZ诱导的GSC周期阻滞的关系尚未见报道。本研究以神经干细胞培养液培养脑胶质瘤U251细胞，提取成球生长的GSC作为研究对象，以重组LINC00152基因慢病毒表达载体转染GSC，获得过表达LINC00152的GSC，并以嘌呤霉素筛选过表达LINC00152的细胞株，观察LINC00152在TMZ诱导GSC周期阻滞中的作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株及主要试剂

人脑胶质瘤U251细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；TMZ（货号34219）购自美国Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、MEM全培养基、无血清干细胞MEM培养基、PBS、重组碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）购自美国Gibco公司；CD133抗体（货号64326S）和Oct-4抗体（货号2750S）购自美国CST公司；GAPDH抗体（货号AP0063）、抗兔IgG-HRP二抗（货号BS13278）、抗小鼠IgG-HRP二抗（货号BS12478）购自南京巴傲得生物科技有限公司；总蛋白提取试剂盒和细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜购自美国Millipore公司；LINC00152慢病毒表达载体转染试剂盒购自上海吉凯基因化学技术有限公司。

1.2 细胞培养、GSC提取

U251细胞以含15%FBS及1%青链霉素的MEM培养基培养细胞放置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中。将U251细胞转至无血清的神经干细胞培养液（含20 pg/L bFGF和20 pg/L EGF）中并加入B27补充剂培养并分离GSC。

1.3 免疫荧光鉴定GSC标志蛋白表达

GSC在4%多聚甲醛中固定30 min后，室温下用Triton X-100透核膜10 min。用含5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBS封闭2 h，于4 ℃下温育一抗CD133（1∶400）和Oct-4（1∶500）过夜，同时以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核。室温温育荧光二抗2 h，PBS洗片后应用荧光显微镜观察拍照。

1.4 构建LINC00152过表达细胞株

以重组LINC00152基因慢病毒表达载体转染GSC细胞构建LINC00152过表达细胞株，设立过表达（LV-LINC00152）组和空载对照（LV）组，同时以正常GSC作为空白对照组。将U251细胞以每孔3×106个接种于6孔板中，当细胞汇合度达50%时进行转染。转染前配制病毒稀释液，各配备两管1 mL含10 μg/mL聚凝胺的MEM全培养基，分别加入100 μL重组LINC00152基因慢病毒原液和空载病毒原液，轻轻混匀。LVLINC00152组加入重组LINC00152基因慢病毒稀释液，LV组加入空载病毒稀释液，空白对照组细胞加入等量培养基，在37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下过夜培养，12 h时更换为MEM全培养基，继续培养至对数期传代，嘌呤霉素筛选稳定过表达LINC00152的细胞株。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）检测LINC00152表达水平

收集LV-LINC00152组、LV组和空白对照组细胞，TRIZOL法提取细胞总RNA，用酶标仪对各组细胞总RNA浓度进行定量，各取1 μg进行反转录，稀释cDNA至500 μL，充分混匀备用。各引物按正向引物与反向引物1∶1稀释，利用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ在ABI 7300型RTFQ-PCR系统中进行扩增，反应条件：95 ℃10 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，共40个循环，每组设置6个复孔。2-△△Ct法计算LINC00152的相对表达水平。

1.6 TMZ处理

取空白对照组、LV组及LV-LINC00152组细胞，TMZ（200 μg·mL-1）处理LV组及LVLINC00152组细胞48 h，设立TMZ+LV组和TMZ+LV-LINC00152组。空白对照组和LV组以等量TMZ溶剂处理48 h。

1.7 细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）法检测细胞活力

取所需空白对照组、LV组及LV-LINC00152组细胞，铺于96孔板中，每孔细胞数为6×103个，培养过夜后以TMZ处理细胞，每组设置5个复孔，同时设立调零孔和对照孔。继续培养48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，培养箱温育3 h，酶标仪测定450 nm处的吸光度（D）值，计算细胞活力。

1.8 流式细胞术检测细胞周期

将处理好的各组细胞用不含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化。收集细胞于离心管中，1 200 rpm离心5 min，PBS洗2次后用70%乙醇在4 ℃环境中固定30 min，固定结束后1 200 rpm离心5 min，PBS洗2次，1 200 rpm离心5 min，加入300 μL PI/RNase染色液，室温避光温育60 min，将温育好的细胞悬液加入样品管中，用流式细胞仪在488 nm激发光处检测。

1.9 蛋白质印迹法（Western blot）检测蛋白水平

药物处理各组细胞48 h后，取出细胞并以蛋白刮刀将贴壁细胞刮下，收集细胞悬液并1 200 rpm离心5 min，弃去上清液，PBS清洗1遍，1 200 rpm离心5 min，弃去上清液，将管内液体吸净，各组细胞加入含1 mmol/L苯甲基磺酰氟的RIPA细胞裂解液，冰上裂解液裂解10 min，4 ℃下12 000 rpm离心20 min，吸取上清液置于冰上备用，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法进行定量，制备样品。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白（各样品上样量为30 μg），转膜，5%脱脂牛奶封闭PVDF膜4 h，洗膜缓冲液（tris buffered saline Tween，TBST）洗膜3次，每次10 min；然后按要求加入CD133（1∶2 000）、Oct-4（1∶1 000）或GAPDH抗体（1∶1 000）4 ℃温育过夜。第2天，TBST洗膜3次，再加入相应的二抗（1∶5 000），室温温育1 h，以ECL化学发光液进行显色，凝胶成像仪进行成像并检测灰度值。

1.10 统计学处理

应用SPSS 11.0软件进行统计学分析，数据以表示。两组间比较采用两独立样本资料的t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两多重比较方法用LSD-t检验。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义（双尾）。

2 结果

2.1 GSC的分离鉴定

U251细胞在含有10%FBS的MEM培养基中以单层细胞贴壁生长。生长24 h后用干细胞培养液进行分离培养，细胞以球形悬浮状态生长。免疫荧光染色发现GSC表达干细胞标志物CD133和Oct-4，表明GSC分离培养成功（图1）。

图1 GSC中CD133和Oct-4蛋白表达变化Fig.1 Changes in CD133 and Oct-4 protein expressions in GSC

2.2 各组GSC中LINC00152表达水平

各组细胞生长至对数期后以RTFQ-PCR检测LINC00152水平，结果显示，空白对照组、LV组和LV-LINC00152组GSC中LINC00152 RNA相对表达水平分别为0.32±0.02、0.33±0.03和1.56±0.12，组间总体比较存在差异（F=519.3，P＜0.000 1），与LV组相比，LV-LINC00152组LINC00152 RNA相对表达水平明显上调（P＜0.000 1，图2）。

图2 各组LINC00152表达水平Fig.2 Expression level of LINC00152 in each group

2.3 LINC00152抵抗TMZ诱导的GSC细胞活力降低

TMZ处理48h后，CCK-8结果 显示，空白对照组、LV 组、TMZ+LV 组和TMZ+LV-LINC00152组GSC细胞活力分别为100.0%、（98.2±9.6）%、（46.2±4.5）%和（77.3±6.8）%，组间总体比较存在差异（F=62.76，P＜0.000 1），空白对照组和LV组无明显差异；与LV组相比，TMZ+LV组细胞活力明显降低（P＜0.000 1）；而与TMZ+LV组相比，TMZ+LV-LINC00152组细胞活力明显升高（P=0.000 1，图3）。

图3 各组细胞活力变化Fig.3 Changes in cell viability of each group

2.4 LINC00152抵抗TMZ诱导的GSC周期改变

TMZ处理48 h后，以流式细胞术检测细胞周期，结果显示，空白对照组、LV组、TMZ+LV组和TMZ+LV-LINC00152组S期GSC细胞比例分别为（9.88±2.26）%、（10.21±3.16）%、（37.28±5.12）%和（17.75±4.06）%，各组间总体比较差异明显（F=34.33，P＜0.000 1），空白对照组和LV组相比无明显差异；与LV组相比，TMZ+LV组S期细胞比例明显增加（P＜0.0001）；而与TMZ+LV组相比，TMZ+LV-LINC00152组S期细胞比例明显降低（P=0.000 2，图4）。

图4 各组细胞周期变化Fig.4 Cell cycle changes in each group

2.5 LINC00152逆转TMZ诱导的GSC中S期相关蛋白水平

TMZ处理48 h后，Western blot检测各组P53、Cyclin A、CDC25A和CDK2蛋白水平变化，结果显示，空白对照组、LV组、TMZ+LV组和TMZ+LV-LINC00152组组间P53（F=65.23，P＜0.000 1）、CyclinA（F=41.85，P=0.000 1）、CDC25A（F=34.38，P＜0.000 1）、CDK2（F=52.22，P＜0.000 1）蛋白水平总体差异明显。空白对照组和LV组相比无明显差异；与LV组相比，TMZ+LV组Cyclin A、CDC25A、CDK2蛋白水平明显下调（P＜0.000 1），P53蛋白表达明显上调（P＜0.000 1）；而与TMZ+LV组相比，TMZ+LV-LINC00152组Cyclin A、CDC25A、CDK2蛋白表达明显上调（P＜0.000 1），P53蛋白水平明显下调（P＜0.000 1，图5）。

图5 各组细胞S期相关蛋白表达变化Fig.5 Changes of S-phase related protein expression in each group

3 讨 论

GSC是存在于脑胶质瘤中的一类自我更新迅速、无限增殖及具有多向分化潜能的细胞［9］。研究［10］显示，GSC与神经干细胞类似，在脑胶质瘤耐药和复发中起到关键性作用。文献［11-12］报道，lncRNA LINC00152异常表达于胶质瘤、肝癌、胃癌及结肠癌等恶性肿瘤中。最新研究［7］显示，LINC00152与脑胶质瘤临床不良预后相关，下调LINC00152基因表达可抑制脑胶质瘤细胞的体内生长，提示LINC00152在胶质瘤中可能发挥促癌效应。本研究以神经干细胞培养液培养脑胶质瘤U251细胞，分离成球生长的细胞球。免疫荧光实验发现，细胞CD133和Oct-4蛋白水平明显上调。CD133和Oct-4已被公认为干细胞标志物用于多种肿瘤干细胞研究［13］。有研究显示，CD133或Oct-4阳性表达是肿瘤细胞获得干细胞特性的标志之一，提示本研究［14-15］成功提取了GSC细胞球。

TMZ作为脑胶质瘤的一线化疗药物，能引起脑胶质瘤细胞周期阻滞和凋亡，具有确切的疗效［3］，但TMZ治疗一段时候后往往会失去疗效。为观察LINC00152在TMZ诱导GSC周期阻滞中的作用，本研究以慢病毒转染法外源性上调LINC00152表达水平并以嘌呤霉素筛选稳定表达的GSC细胞株。结果发现，TMZ能诱导GSC细胞活力降低和S期阻滞，而LINC00152过表达能抑制上述效应，提示LINC00152可能通过减少S期阻滞从而抵抗TMZ诱导的GSC细胞活力降低。本研究进一步观察了S期相关蛋白的表达变化，结果显示，TMZ能诱导Cyclin A、CDC25A、CDK2蛋白表达下调以及P53蛋白表达上调，而LINC00152过表达可抑制上述效应。研究［16-17］表明，Cyclin A-CDK2是细胞S期启动DNA复制的重要复合物。另有文献［18］报道，多柔比星可诱导肝癌HepG-2细胞S期阻滞，从分子水平上发现细胞Cyclin A、CDK2及CDC25A表达下调。还有研究［19］显示，miR-155可通过上调P53蛋白表达诱导前列腺癌细胞周期阻滞，提示本研究中的TMZ可能通过下调Cyclin A、CDK2、CDC25A蛋白表达及上调P53蛋白表达，从而诱导GSC细胞S期周期阻滞，而过表达LINC00152可抑制上述效应。

综上所述，TMZ可通过下调Cyclin A、CDC25A、CDK2蛋白表达及上调P53蛋白表达，进而诱导GSC细胞S期阻滞。本研究发现，lncRNA LINC00152可抑制TMZ诱导的GSC细胞P53、Cyclin A、CDC25A、CDK2蛋白表达变化及S期阻滞，这些研究结果有望为临床治疗脑胶质瘤提供新的思路。但lncRNA LINC00152在脑胶质瘤中的生物学功能还有待于更多研究证实。