强直性脊柱炎患者血清Dickkopf-1蛋白水平分析*

胡佳琳 郝 喆 杨颖莹 曾 昆,# 王 丹

强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)是以中轴关节慢性炎症为主的全身性自身免疫性疾病。随着病情的发展，软骨组织逐渐被骨组织替代，导致关节强直和功能丧失，是AS的重要发病机制[1,2]。而导致AS脊柱僵硬和丧失活动能力的主要病理改变为关节炎症和新骨形成[3]。由于AS 患者可同时存在骨质疏松及新骨形成，故在疾病不同阶段其骨代谢情况可能不同。近年来，内源性Wnt通路的负调控蛋白如Dickkopf相关蛋白DKK-1引起了临床极大的重视，多个临床前研究显示DKK-l在抑制成骨细胞的同时激活破骨细胞，从而导致骨稳态破坏，抑制骨形成[4,5]。本文对AS患者的血清DKK-l水平进行检测，旨在分析AS患者血清DKK-1水平变化并探讨其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象和分组

收集我院风湿科2016-12—2018-06门诊及住院确诊治疗的 AS患者50例(AS组),男35例，女15例，平均年龄34.77±9.68岁，其中使用TNF-α抑制剂治疗者21例(使用TNF-α抑制剂治疗组)，男15例，女6例，平均年龄(33.62±10.02)岁，平均病程(3.62±0.67)年。未使用TNF-α抑制剂治疗者29例(未使用TNF-α抑制剂治疗组)，男20例，女9例，平均年龄(35.91±9.33)岁，平均病程(3.83±2.35)月。AS患者均符合1984年修订的纽约标准[6]。所有研究对象知情同意，自愿参加，并签署知情同意书。另选取同期体检健康者50例作为对照(对照组)，男33例，女17例，平均年龄(33.02±8.18)岁。AS组与对照组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。使用TNF-α治疗组与未使用TNF-α治疗组性别、年龄及病程比较差异亦无统计学意义(P>0.05)。排除: (1)有严重心、肝、肾等重要脏器和血液、内分泌系统病变病史以及有多发性硬化病史者；(2)孕妇、哺乳期妇女；(3)正处于急、慢性感染期间, 查体时发现有泌尿系、心肺、口咽、五官等感染者；(4)现患或有活动性结核病史者；(5)恶性肿瘤患者；(6)炎性肠病,或银屑病, 或活动性前葡萄膜炎患者。

1.2 治疗方法

使用TNF-α抑制剂治疗组患者给予注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(益赛普，上海中信国建药业股份有限公司，国药准字 S20050058)治疗，每次 25mg，每周 2 次，皮下注射治疗，持续6个月。未使用TNF-α抑制剂治疗组不接受任何TNF-α抑制剂治疗，接受以下药物治疗：甲氨蝶呤片，上海信谊药厂有限公司，国药准字H31020644，每次10mg，每周1次，口服，持续6个月；柳氮磺吡啶肠溶片，上海信谊药厂有限公司，国药准字H31020840，每次1.0g，每天2次，口服，持续6个月；西乐葆，辉瑞制药有限公司，国药准字J20140072，每次0.2g，每天1-2次，口服，持续3-6个月/乐松，第一三共制药(上海)有限公司，国药准字H20030769，每次60mg，每天3次，口服，持续3-6个月。

1.3 观察指标和方法

1.3.1血液学指标：采集AS组患者治疗前及治疗6个月后空腹肘静脉血于促凝剂管和血沉管，促凝剂管血液3 000转/min离心10min分离血清，一部分血清保存于-80℃，待样本收齐后批量检测用于DKK-1水平，一部分血清于2h内完成CRP水平检测；血沉管血液用于血沉检测。(1)DKK-1水平检测：冰箱取出血清后室温解冻，由湖北百奥斯生物科技有限公司采用ELISA法检测血清DKK-1水平，使用美国MD公司VERSAmax酶标测试仪，试剂盒由武汉优尔生商贸有限公司提供，货号为SEA741Hu，严格按照使用说明书进行操作检测。 (2)ESR、CRP水平检测： ESR使用意大利Monior 20/100型全自动血沉仪及其配套试剂盒，严格按照使用说明书进行操作检测。CRP使用德国Siemens BN II/BNP rospec全自动蛋白分析仪及其配套试剂盒采用速率放射比浊法检测，严格按照使用说明书进行操作检测。对照组平行检测相同指标。

1.3.2AS疾病活动指数(bath AS Disease Activity Index，BASDAI)评定[7]：于治疗前及治疗6个月后评价AS组患者BASDAI，共包含6个项目，分别为疲劳、脊柱痛、外周关节痛、局限性压痛以及晨僵的持续时间和程度。BASDAI≥4分提示疾病活动。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 AS组与对照组各指标结果比较

AS组患者的血清DKK-l水平低于对照组(P<0．01)。AS组患者的ESR和CRP均高于对照组(P<0．01)。见表l。

表1 AS组与对照组DKK-l、ESR和CRP的水平比较

注:与对照组比较，1)P<0.01

2.2 使用TNF-α抑制剂治疗组与未使用TNF-α抑制剂治疗组患者BASDAI、DKK-l、ESR及CRP结果比较

治疗前，两组BASDAI、DKK-l、ESR及CRP差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后，两组BASDAI、ESR及CRP水平均较治疗前降低(t值分别为6.80和15.65；13.19和14.81；12.13和11.28；P<0.01)，且使用TNF-α抑制剂治疗组ESR、CRP及BASDAI较未使用TNF-α抑制剂治疗组降低更明显，差异均有统计学意义(P<0.01)。两组内治疗前后DKK-l差异无统计学意义(t值分别为-1.72和-1.76，P>0.05)。两组间治疗后DKK-l差异亦无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 AS患者DKK-l与疾病活动度和炎症指标的相关性分析

使用TNF-α抑制剂治疗组与未使用TNF-α抑制剂治疗组DKK-l与BASDAI、ESR及CRP均无相关性(P>0.05)。见表3。

表2 使用TNF-α抑制剂治疗组与未使用TNF-α抑制剂治疗组疾病活动度和各实验室指标结果比较

注:与未使用TNF-α抑制剂治疗组比较，1)P<0.01；与同组治疗后比较，2)P<0.01

表3 AS患者DKK-l与疾病活动度和炎症指标的相关性分析

3 讨 论

DKK-1能通过与Wnt信号传递途径与相应的受体结合来调控细胞的分化、增殖、迁移或癌变等特性，DKK-1的这些功能在肿瘤发生方面发挥了重要作用。而新近研究发现，Wnt信号通路可能参与了AS患者韧带骨赘的形成[8，9]。DKK-1能干扰Wnt蛋白结合而阻断Wnt通路，从而使骨形成减少。但DKK-1是否通过这个途径参与AS新骨的形成还不清楚。本研究发现，AS组患者血清DKK-1水平明显低于对照组，表明DKK-1与AS疾病相关。同时发现血清DKK-1水平与疾病活动度指标BASDAI、 ESR及CRP 无明显相关性。为进一步明确DKK-1与AS的关系，本文比较了使用TNF-α抑制剂治疗组与未使用TNF-α抑制剂治疗组DKK-1水平。经过6个月的治疗，两组BASDAI、ESR、CRP均较治疗前降低，但两组治疗前后血清DKK-l的比较差异无统计学意义(P>0.05)。这提示血清DKK-1水平与疾病的炎症及疾病活动度均无明显关系，且 TNF-α抑制剂对诱导AS患者血清DKK-1的表达作用不明显。相关研究[10-13]已经报道，AS患者血清DKK-l水平低于健康人群，这与本文结果一致，但经TNF-α抑制剂治疗后,AS患者血清DKK-l水平变化情况的报道结论不一[14-17]，这可能是导致不同患者不同结局的原因之一[18,19]。理论上通过阻断DKK-l上调Wnt信号通路，可导致破骨细胞形成和骨吸收被抑制，进而导致成骨细胞分化成熟，促进新骨的形成。因此或许可以通过升高DKK-l水平而达到抑制新骨形成的作用。但本研究发现，血清DKK-l水平与疾病活动度及炎症指标水平均无明显相关性，提示血清DKK-l调控可能并不受炎症影响。李振彬等[20]研究认为AS患者存在炎症与骨破坏/新骨形成的分离现象，这与本文结果一致。AS新骨形成的过程与疾病炎症活动可能是相对独立的两个过程。

综上所述，DKK-1可能参与AS的新骨形成过程,但TNF-α抑制剂对AS的新骨形成可能无阻止作用。提示临床对AS的治疗中除了抑制炎症、控制疾病活动度以外，还要重视针对新骨形成的干预，需要进一步探索AS新骨形成的病理过程，为AS患者治疗提供新的靶点。

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