MAST3对胃癌细胞SGC-7901细胞增殖及迁移的作用

王 磊，陈 鹤，张 敏，王中新

胃癌作为目前常见的恶性肿瘤之一[1]，具有较复杂的发病、侵袭及转移机制。其癌变过程是长期的细胞生物学行为由正常演变为异常的过程, 其发病与端粒酶激活、抑癌基因失活和癌基因激活等引发的多因素、多阶段及多基因变异相关[2-3]。

目前有关MAST3基因的研究主要集中在炎症性肠病中，研究[4-5]表明缺失MAST3的细胞能够使Toll样受体4依赖的NF-κB的活性下降，由此也进一步证明了NF-κB途径在炎症性肠病发病机制中起到重要作用。但对于MAST3基因在胃癌发生、发展中的作用及其机制等尚未完全明确。本研究旨在观察MAST3在胃癌中的表达情况以及探索干扰及过表达MAST3对胃癌细胞SGC-7901细胞增殖及迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂胎牛血清来源于美国PAN公司；DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司；Opti-MEM购自美国Gibco公司；转染使用的Lipofectamine 2 000 Reagent试剂购自美国Invitrogen公司；人外源性生长因子TGF-β购自美国PeproTech公司；TRIzol购自美国Invitrogen公司；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix和SYBR Green PCR Master Mix均购自日本TOYOBO公司；RIPA裂解液和细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；小鼠抗β-actin抗体和兔抗MAST3抗体购自美国Bioworld公司；山羊抗兔和山羊抗小鼠的二抗购自北京中杉生物技术公司；细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、C-myc抗体、MMP-3和MMP-9购自美国Cell signaling technology公司；MAST3的过表达质粒与小干扰RNA均购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2 样本收集与细胞培养选取临床中6例33～78(61±4.8)岁胃癌患者，在手术后分别选取胃癌和癌旁组织，生理盐水清洗后，多聚甲醛固定和冰冻保存，同时患者已签署知情同意书。

人胃癌细胞株SGC-7901细胞来自安徽医科大学药学院赠送，使用含10%胎牛血清的培养基于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.3 细胞转染转染使用对数生长期的细胞, 按照说明书使用Lip2000将MAST3-RNAi和pEx-3-MAST3分别转染到SGC-7901细胞中，6 h后使用TGF-β进行刺激。细胞转染48 h后，收集细胞进行后续研究。

1.4 qRT-PCR检测细胞中MAST3、CyclinD1、C-myc、MMP-3和MMP-9 mRNA的表达使用TRIzol法提取组织和细胞中总RNA，并使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix逆转录成cDNA。根据SYBR Green PCR Master Mix说明书步骤进行qRT-PCR检测。

1.5 Western blot印迹法检测细胞中MAST3、CyclinD1、C-myc、MMP-3和MMP-9蛋白表达的改变收集组织和处理后的细胞，并使用蛋白裂解液裂解；离心后提取组织和细胞中的总蛋白，并加入SDS-蛋白上样缓冲液煮沸变性。使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测蛋白相对表达量。按照组别依次加样，依次电泳、转膜、封闭后，一抗(稀释浓度均为1 ∶500)孵育过夜，之后二抗(稀释浓度均为1 ∶5 000)孵育1 h。使用凝胶成像分析系统扫描成像并分析。

1.6 流式细胞仪检测细胞周期收集处理后的细胞，冷PBS清洗2次后，使用70%乙醇固定变性过夜。离心、清洗后收集细胞，根据说明书加入500 μl 缓冲液重悬细胞，分别加入RNaseA、PI，4 ℃避光孵育30 min后上机检测分析。

2 结果

2.1 MAST3在胃癌组织中的表达为了探究MAST3在胃癌中的作用，本研究首先选取胃癌组织和癌旁组织，并通过Western blot和qRT-PCR检测MAST3的表达情况。qRT-PCR和Western blot结果显示，胃癌组织中MAST3 mRNA和蛋白表达均高于癌旁组织，且差异有统计意义(F=21.36，P<0.01；F=18.76，P<0.01)，见图1A、1B。同时，本研究还检测了TGF-β1对胃癌细胞株SGC-7901细胞中MAST3的表达的影响，TGF-β1能够上调SGC-7901细胞中MAST3 mRNA和蛋白的表达，且差异有统计意义(F=33.81，P<0.01；F=28.71，P<0.01)，见图1A、1C。提示，MAST3与胃癌的发生有着密切的关系。

2.2 沉默MAST3对SGC-7901细胞增殖及迁移的影响使用MAST3-RNAi沉默SGC-7901细胞中MAST3的表达，观察对SGC-7901细胞增殖和迁移的影响。qRT-PCR和Western blot结果证实MAST3-RNAi能够降低TGF-β1刺激SGC-7901细胞中MAST3 mRNA和蛋白的表达，且差异有统计意义(P<0.01)，见图2A、2B。同时本研究还检测了细胞增殖相关基因C-myc和 CyclinD1的表达变化，qRT-PCR和Western blot结果表明MAST3-RNAi能够降低TGF-β1刺激SGC-7901细胞中C-myc和 Cy-clinD1 mRNA和蛋白的表达，且差异有统计意义(P<0.01)，见图2C、2D。细胞周期研究结果也表明，MAST3-RNAi组S期和G2/M期细胞比例(45±5.2)%明显低于NC-RNAi组S期和G2/M期细胞比例(65±8.7)%，且差异有统计意义(P<0.05)，见图2E。本研究检测了细胞迁移相关基因MMP-3和MMP-9的表达变化，qRT-PCR和Western blot结果都表明MAST3-RNAi能够下调TGF-β1刺激SGC-7901细胞中MMP-3和MMP-9 mRNA和蛋白的表达，且差异有统计意义(P<0.01)，见图2F、2G。提示抑制MAST3表达可以抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖及迁移能力。

图1 MAST3在胃癌中的表达变化

A：qRT-PCR检测MAST3 mRNA表达，胃癌组织(左侧)，TGF-β1刺激SGC-7901细胞(右侧)；B：Western blot检测MAST3 蛋白在胃癌中的表达；C：Western blot检测TGF-β1刺激SGC-7901细胞中MAST3蛋白的表达；1：癌旁组织；2：胃癌组织；3：对照组；4：TGF-β1刺激组；与癌旁组织比较：**P<0.01；与对照组比较：##P<0.01

2.3 过表达MAST3对SGC-7901细胞增殖及迁移的影响为了进一步探究MAST3在胃癌中的作用，使用过表达质粒pEx-3-MAST3过表达SGC-7901细胞中MAST3的表达。qRT-PCR和Western blot结果证实pEx-3-MAST3能够增加TGF-β1刺激SGC-7901细胞中MAST3 mRNA和蛋白的表达，且差异有统计意义(P<0.01)，见图3A、3B。qRT-PCR和Western blot结果表明pEx-3-MAST3能够升高TGF-β1刺激SGC-7901细胞中C-myc和CyclinD1 mRNA和蛋白的表达，且差异有统计意义(P<0.01)，见图3C、3D。细胞周期结果也表明，pEx-3-MAST3组S期和G2/M期细胞比例(77±4.8)%高于pEx-3组S期和G2/M期细胞比例(66±5.1)%，且差异有统计意义(P<0.05)，见图3E。qRT-PCR和Western blot结果也都表明pEx-3-MAST3能够上调TGF-β1刺激SGC-7901细胞中MMP-3和 MMP-9 mRNA和蛋白的表达，且差异有统计意义(P<0.01)，见图3F、3G。提示，增加MAST3表达能够增加胃癌细胞SGC-7901的增殖及迁移能力。

图2 MAST3-RNAi对SGC-7901细胞增殖及迁移的影响

A：qRT-PCR检测MAST3 mRNA在SGC-7901中的表达；B：Western blot检测MAST3蛋白在SGC-7901中的表达；C：qRT-PCR检测SGC-7901细胞中C-myc和CyclinD1 mRNA的表达；D：Western blot检测SGC-7901细胞中C-myc和CyclinD1蛋白的表达；E：流式细胞仪检测SGC-7901细胞细胞周期；F：qRT-PCR检测SGC-7901细胞中MMP-3和MMP-9 mRNA的表达；G：Western blot检测SGC-7901细胞中MMP-3和MMP-9蛋白的表达；1：正常组；2：TGF-β1刺激组；3：TGF-β1刺激+NC-RNAi组；4：TGF-β1刺激+MAST3-RNAi组；与正常组比较：##P<0.01；与TGF-β1刺激+NC-RNAi组比较：**P<0.01

图3 pEx-3-MAST3对SGC-7901细胞增殖及迁移的影响

A：qRT-PCR检测MAST3 mRNA在SGC-7901中的表达；B：Western blot检测MAST3蛋白在SGC-7901中的表达；C：qRT-PCR检测SGC-7901细胞中C-myc和 CyclinD1 mRNA的表达；D：Western blot检测SGC-7901细胞中C-myc和CyclinD1蛋白的表达；E：流式细胞仪检测SGC-7901细胞细胞周期；F：qRT-PCR检测SGC-7901细胞中MMP-3和MMP-9 mRNA的表达；G：Western blot检测SGC-7901细胞中MMP-3和MMP-9蛋白的表达；1：正常组；2：TGF-β1刺激组；3：TGF-β1刺激+ pEx组；4：TGF-β1刺激+pEx-3-MAST3组；与正常组比较：##P<0.01；与TGF-β1刺激+pEx组比较：**P<0.01

3 讨论

胃癌发病机制较为复杂，尚未能完全明确，目前仍未有彻底治愈胃癌的治疗手段。肿瘤的发生发展是多基因参与的复杂过程, 包括癌基因的异常激活和抑癌基因失活[6]。随着细胞分子生物学研究的进展，肿瘤的基因靶向治疗成为国内外研究热点，为寻求新的治疗方式应用于临床，以达到更好的治疗效果。

MAST家族是相对未知的激酶分支，而MAST3是MAST家族成员之一，序列同一性分析以及功能测定已显示MAST3参与许多细胞免疫应答的调节过程[7-8]。有研究[5]显示MAST3在鼠和人的免疫细胞中表达，同时阐明MAST3在调节肠道炎症中蛋白质相互作用中的功能将有助于确定导致肠道炎症的复杂分子机制[9-10]。本研究中, 通过qRT-PCR及Western blot检测MAST3的表达，结果表明胃癌中MAST3 mRNA和蛋白表达明显高于癌旁组织，说明MAST3与胃癌的发生有着密切的关系。

TGF-β1是一种转化生长因子，它通常被用来诱导SGC-7901细胞发生上皮间质转化，使细胞发生增殖、迁移等，从而加重胃癌的发生发展[11]。本研究显示TGF-β1能够增加胃癌细胞株SGC-7901细胞中MAST3 mRNA和蛋白的表达。同时，本研究还显示MAST3表达可以影响细胞周期蛋白CyclinD1和癌基因C-myc表达。CyclinD1和C-myc已经被证明参与细胞的增殖，能够反映细胞增殖情况[12]。Western blot和qRT-PCR结果表明，使用MAST3-RNAi后，CyclinD1、C-myc的蛋白及mRNA表达下调。相反，pEx-3-MAST3增加MAST3表达后，CyclinD1、C-myc的蛋白及mRNA表达明显上调。说明MAST3可能参与胃癌细胞的增殖。为了进一步确认并观察MAST3对细胞增殖的作用，本研究还分析细胞周期情况，结果显示MAST3-RNAi能够降低SGC-7901细胞中S期和G2/M期细胞比例，抑制了细胞的有丝分裂，从而阻滞了细胞增殖；同时，过表达MAST3后，能够增加SGC-7901细胞中S期和G2/M期细胞比例。这进一步说明了MAST3的表达可以调控SGC-7901细胞的增殖，从而参与胃癌的发生。

本研究还表明MAST3表达可以影响SGC-7901细胞的迁移。Western blot和qRT-PCR结果显示，使用MAST3-RNAi后，MMP-9和MMP-3的蛋白及mRNA表达下调。相反，pEx-3-MAST3增加MAST3表达后，MMP-9和MMP-3的蛋白及mRNA表达明显上调。提示MAST3可能会影响SGC-7901细胞的迁移。