IRF9基因沉默对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞凋亡的影响

薛彬华，余维丽，王小蝶，刘 奕

中图分类号R 34

文献标志码A文章编号1000-1492(2020)04-0508-05

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是由胰腺的急性炎症所引发的一种疾病，其特点是炎症发生和胰腺坏死及凋亡[1]。据报道[2]，胰腺腺泡细胞炎症的发生、增殖、凋亡均参与AP的发生发展。IRF9是干扰素调节因子(interferon regulatory factor，IRF)中的一员，迄今为止，在哺乳动物中发现了9种IRF：IRF1～9[3]。越来越多的证据表明IRF在转录调控、应激反应、细胞因子信号转导、凋亡和增殖调控及自稳平衡、炎症反应等方面都有着重要的作用[3-6]。IRF参与多种疾病的发生发展过程，包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎症性肠病，以及肿瘤发生及心血管疾病等[3-4,7]。干扰素调节因子IRF9在AP中的具体机制目前未见文献报道。该课题旨在研究IRF9基因沉默对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞AR42J凋亡的影响，阐释IRF9基因在AP发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养大鼠胰腺腺泡细胞AR42J购于上海富衡细胞库。细胞培养基DMEM+100 mg/L青霉素+10%胎牛血清，1～2 d传代。Opti-MEM(x1)和Lipofectamine 2000均购于美国LifeTechnology公司。

1.2 试剂IRF9的siRNA序列及一对阴性对照序列购于上海吉玛制药技术有限公司；DEME/H培养基、RIPA裂解液、TRIzol试剂、ECL荧光剂(显影剂)、BCA蛋白浓度试剂盒购于合肥塞维尔生物科技有限公司。PVDF膜购于美国Millipore公司，雨蛙素粉末购于北京索莱宝科技有限公司。

1.3 IRF9-siRNA转染胰腺AR42J细胞将培养至对数期的AR42J细胞接种至6孔板，待细胞密度达到90%，用PBS洗2次，每孔加入1 500 μl Opti-MEM。将细胞分组为空白对照组、阴性对照组和IRF9沉默组。使用Lipofectamine 2000进行si-RNA转染，24 h后使用雨蛙素诱导。

1.4 qRT-PCR检测各组AR42J细胞中IRF9及凋亡相关基因Caspase 3及Caspase 9的mRNA水平取转染成功的细胞，按照TRIzol试剂操作说明书提取细胞中总RNA。后逆转录成cDNA备用，流程参照逆转录试剂盒说明书。IRF9基因上游引物序列：5′-CTGCTCACCTTCATCTACAACG-3′；下游引物序列：5′-ACTAGGATGCCCCTCTCAA-3′；Caspase 3正义引物：5′-GCGGTATTGAGACAGACAGTGGAAC-3′,反义引物：5′-GCGGTAGAGTAAGCATACAGGAAGTC-3′及Caspase 9正义引物：5′-GGGCTCAGCACACGCATTGG-3′,反义引物：5′-TTCTTAGCAGTCAGGTCGTTCTTCAC-3′；GAPDH基因上游引物序列：5′-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′，下游引物序列：5′-TGTCATATTTGGCAGGTTT-3′。采用荧光定量PCR扩增仪按照以下条件进行荧光定量PCR反应：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，共40个循环；95 ℃、1 s，60 ℃、15 s，95 ℃、5 s，反应结束后以GAPDH基因作为内参照，计算IRF9、Caspase 3及Caspase 9的mRNA相对表达量。

1.5 Western blot法检测各组AR42J细胞中IRF9及凋亡相关基因Caspase 3及Caspase 9蛋白的表达水平Western blot法检测各组细胞中的IRF9、Caspase 3及Caspase 9蛋白的表达情况。取转染成功的AR42J细胞，PBS清洗细胞后，提取各组细胞的总蛋白，用SDS-PAGE电泳分离蛋白，转至PVDF膜，按顺序孵育一抗，二抗，用ECL化学发光底物显影检测蛋白。最后用Image-Proplus图像处理系统分析并计算 Western blot灰度值。

1.6 流式细胞仪检测各组AR42J细胞凋亡情况AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测：取转染成功后的AR42J细胞，用不含EDTA的胰酶消化细胞后，按凋亡试剂盒说明书染色，用CytoFLEX流式细胞仪检测各组凋亡率，用CytExpert分析软件分析实验结果。

2 结果

2.1 qRT-PCR结果雨蛙素诱导前与空白对照组比较，沉默组的IRF9基因的mRNA表达水平降低，差异有统计学意义(F=58.762，P<0.05)，Caspase 3及Caspase 9基因的mRNA表达水平亦降低，差异有统计学意义(F=5.987，F=5.894，P<0.05)；而阴性对照组的IRF9、Caspase 3及Caspase 9的mRNA表达水平无明显差异。 雨蛙素诱导24 h后，各组中的IRF9基因的mRNA水平均较雨蛙素诱导前升高(F=28.250，P<0.05)；凋亡相关基因Caspase 3及Caspase 9的mRNA的表达水平亦较诱导前升高(F=6.370，F=6.979，P<0.05)。见图1～3。

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：IRF9沉默组;与空白对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：IRF9沉默组;与空白对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

图3 雨蛙素(100 nmol/L)诱导及IRF9基因沉默的AR42J细胞Caspase 9的mRNA表达的影响

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：IRF9沉默组;与空白对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

2.2 Western blot 结果① 雨蛙素诱导前，阴性对照组AR42J细胞内的IRF9蛋白的表达与空白对照组比较无明显变化。IRF9沉默组AR42J细胞内IRF9蛋白的表达是降低的，差异有统计学意义(F=10.712，P<0.05)，说明IRF9基因沉默成功，见图4，5。②雨蛙素诱导24 h后，各组中的IRF9基因的蛋白水平均较雨蛙素诱导前升高(F=5.915，P<0.05)，见图5。凋亡相关基因Caspase 3及Caspase 9的蛋白的表达水平较诱导前升高(F=4.315，F=4.924,P<0.05)，见图6,7。

图4 Western blot 法检测雨蛙素(100 nmol/L)诱导及IRF9沉默的AR42J细胞IRF9、Caspase 3、Caspase 9蛋白的表达水平

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：IRF9沉默组

图5 雨蛙素(100 nmol/L)诱导及IRF9基因沉默的AR42J细胞IRF9蛋白表达的影响

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：IRF9沉默组;与空白对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：IRF9沉默组;与空白对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

图7 雨蛙素(100 nmol/L)诱导及IRF9沉默的AR42J细胞Caspase 9蛋白表达的影响

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：IRF9沉默组;与空白对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

2.3 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测的结果雨蛙素诱导前，空白对照组(CON)凋亡率是：10.955±1.386，IRF9-NC-siRNA组(NC)凋亡率是：9.453±0.991，IRF9-siRNA组凋亡率是7.755±0.823， IRF9沉默组AR42J细胞的凋亡率是降低的，差异有统计学意义(F=157.772，P<0.05)。雨蛙素诱导24 h后，对照组(CON+)凋亡率是：19.255±1.362，IRF9-NC-siRNA(NC+)组凋亡率是：17.570±1.600；IRF9-siRNA组凋亡率是15.708±3.074，雨蛙素诱导24 h后IRF9沉默组R42J细胞的凋亡率亦是下降的，差异有统计学意义(F=63.217，P<0.05)。与空白对照组和阴性对照组比较，IRF9-siRNA转染24 h后的AR42J细胞的凋亡率是降低的。

图8 雨蛙素诱导前各组AR42J细胞凋亡率比较

图9 雨蛙素(100 nmol/L)诱导后各组AR42J细胞凋亡率比较

图10 雨蛙素(100 nmol/L)诱导前及诱导后各组AR42J细胞凋亡率

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：IRF9沉默组;与空白对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

3 讨论

AP是一种临床上常见的危重症，由多种病因引起的胰酶激活，继以胰腺局部炎症反应为主要特征，病情较重者可发生全身炎症反应综合征并可伴有器官功能障碍、代谢性酸中毒、休克等严重后果，其病死率较高，预后较差[8]。当胰腺炎发生时，胰腺腺泡细胞受到损伤，细胞坏死的数量增加，细胞内各种酶和细胞器被释放，并伴有急性炎症，导致急性重症胰腺炎[9]。此外，AP的病理特征涉及腺泡细胞凋亡和炎症反应等方面。凋亡是细胞正常的生理过程，包括细胞核形态学改变和相关基因表达，从而引起细胞程序性死亡。Caspase 3是白细胞介素-1β 转化酶家族成员，是凋亡的执行者，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的通路。在各种刺激因子作用下，死亡受体或细胞内死亡信号被激活，Caspase 3被上游的Caspase 9激活，同时Caspase 7也被激活，形成凋亡复合体，促使细胞凋亡。本研究采用RNA干扰技术沉默IRF9基因，随后应用雨蛙素诱导建立体外AP模型，通过qRT-PCR及Western Blot技术检测IRF9、凋亡相关基因Caspase 3及Caspase 9的mRNA及蛋白的表达水平，流式细胞术检测各组AR42J细胞凋亡情况。本研究结果表明：与空白对照组比较，沉默组IRF9基因的mRNA及蛋白水平均下降，差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组IRF9基因的mRNA及蛋白水平无明显差异，说明IRF9基因沉默成功。雨蛙素诱导24 h后，各组中的IRF9基因的mRNA及蛋白水平均较雨蛙素诱导前升高；凋亡相关基因Caspase 3及Caspase 9的mRNA及蛋白的表达水平亦升高，说明AP发生时IRF9及凋亡相关基因表达水平均上调，IRF9基因沉默后凋亡相关基因Caspase 3及Caspase 9的mRNA及蛋白的表达水平被抑制；与空白对照组及阴性对照组相比，雨蛙素诱导后IRF9沉默组AR42J细胞的凋亡率有明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。这些结果表明在AP发生时IRF9基因上调，凋亡相关基因表达水平升高，促进了细胞凋亡，而IRF9基因沉默能够降低凋亡相关基因的表达，降低细胞的凋亡率。本研究提示IRF9可能是AP诊断和治疗的一个靶标，可能为今后AP的诊断和治疗提供了理论指导和实验依据。