基于RNA-seq技术对重度子痫前期孕妇胎盘组织差异性表达circRNA的研究

周芝熠，李晓娟，蒋国庆，钱 源

子痫前期(preeclampsia,PE)是以新发高血压、蛋白尿为主要临床表现、 全身小动脉痉挛为主要病理特点的妊娠期特有疾病，可导致母婴死亡率和发病率增加，其发病机制尚未完全明确，已有的研究[1]表明是多种因素共同作用的结果。其中，胎盘异常在PE发病机制中起重要作用这一观点已被普遍接受。胎盘具有物质合成、交换、代谢以及防御功能，在维持妊娠过程发挥着重要作用。当胎盘功能出现异常时，如螺旋动脉血管重铸不足引起的胎盘“浅着床”；或胎盘源性生理物质分泌调节异常，引起新陈代谢、炎性反应、血管生成的调控失调等，都可促使PE的发生[2]。

环状RNA(circRNA)是一种特殊类型的非编码RNA，广泛存在于生物体。不同于传统的线性RNA，circRNA来源于 “反向剪接”过程，形成了既不具有极性也不具有多聚腺苷酸尾的从5'到3'端的共价闭环结构[3]，这使得它比线性RNA更稳定。circRNA在不同个体具有高度的组织特异性、细胞特异性，并有稳定的表达水平。此外，除少数circRNA外，其中大多数在物种之间具有高度保守的序列[4]。这些特征使circRNA的异常表达有潜在的介导某些特殊疾病发生的可能性。circRNA可能通过以下5种方式发挥其生物学功能：miRNA海绵、作为翻译模板、调控基因转录、与RNA结合蛋白作用、螯合蛋白质[4-5]。circRNA与人类多种疾病的发病机制有密切关系，但有关circRNA对PE作用的研究较少。因此，该研究检测了sPE胎盘circRNA的表达水平并预测了这些circRNA的靶miRNA，想由此提供一种新的研究PE发病机制和检测手段的途径。

1 材料与方法

1.1 病例资料本研究纳入的6例胎盘组织来自于昆明医科大学第一附属医院分娩的单胎初产妇，其中sPE患者3例(实验组)；正常妊娠妇女3例(对照组)。sPE组纳入标准：符合sPE诊断标准：sPE定义为轻度PE和一个或多个以下其他不良特征的综合：① 收缩压≥21.33 kPa和(或)舒张压≥14.67 kPa；② 蛋白尿≥5 g/24 h或随机蛋白尿()；③ 其他临床上的妊娠综合征(包括脑神经症状、乳酸脱氢酶>600 IU/U,天冬氨酸转氨酶或丙氨酸转氨酶>70 IU/U，血小板数量<100×109个细胞/L等)。对照组纳入标准：符合正常妊娠诊断标准：① 妊娠经过顺利；② 血压<18.67/12 kPa；③ 无蛋白尿。排除标准：排除合并心血管疾病、肝肾疾病、糖尿病、急慢性感染性疾病及胎儿染色体异常或发育畸形等妊娠合并症病史。每位患者被告知胎盘用途，并签署知情同意。

1.2 方法

1.2.1标本采集 顺产胎盘娩出后，在胎盘母体面和胎儿面无钙化区和出血点的部位采集数块面积约1 cm×1 cm×1 cm的胎盘组织，并在生理盐水中反复漂洗去除血污，干纱布吸除水分后加入RNA later -80 ℃的冰箱保存，准备进行组织中的RNA提取。

1.2.2circRNA-seq检测 按TRIzoI说明书提取胎盘组织总RNA。采用RNA完整性和纯度检测合格的RNA，通过去除rRNA，合成双链DNA，末端修复、连接测序接头，片段选择、降解第二链cDNA，PCR富集、文库质检等过程，再对富集的 cDNA 进行高通量测序。对测序质量合格的circRNA进行鉴定，将测序序列数目(read count)≥2的候选 circRNA 作为鉴定的 circRNA。接着对候选circRNA进行差异表达分析，circRNA差异表达的输入数据为circRNA表达水平分析中得到的readcount数据。从差异倍数和校正后的显著水平两个水平进行评估，对差异circRNA进行筛选。

1.2.3靶基因预测 利用miRanda软件对筛选获得的差异性circRNA进行下游miRNA预测。

1.3 统计学处理采用Illumina Casava 1.8版本测序平台对原始数据进行测序，使用 find_circ软件鉴定circRNA和TPM进行表达量归一化处理，用DEGseq进行circRNA差异分析。差异circRNA筛选默认筛选条件为：qvalue<0.01 && |log2(foldchange)|>1。

2 结果

2.1 circRNA在子痫前期患者胎盘中的表达情况共检测出12 000个circRNA，其中有3 007个在对照组和实验组中均有表达(图1)。比较这3 007个circRNA，发现89个差异性表达的circRNA，其中上调的circRNA有44个，下调的circRNA有45个(图2)。上调和下调的circRNA差异倍数在5倍以上的分别为4个、10个。表1列出了上调和下调倍数最明显的十个基因的基本信息。

图1 circRNA的维恩图

图2 差异性表达circRNA聚类图

红色代表上调基因；蓝色代表下调基因；C：对照组；P：实验组

表1 上调/下调倍数前十的差异性表达circRNA

2.2 circRNA靶基因预测结果在筛选出的89个circRNA中，发现有75个circRNA具有has-let-7家族成员的结合位点，与miR-100、miR-101、miR-103家族成员有结合位点的circRNA个数分别是49、53和65个。与这4种miRNA均有合位点的circRNA有40个。其中，hsa_circ_0004383、hsa_circ_0000294、hsa_circ_0000645、hsa_circ_0010783、hsa_circ_0011179、hsa_circ_0011828、hsa_circ_0011962这七个差异性表达在5倍以上的circRNA与这四种miRNA皆有结合位点(图3)。

图3 差异性表达在5倍以上的circRNA与其靶miRNA的网络图

红色(圆形)：circRNA；黄色(三角形)：miRNA

3 讨论

PE是孕产妇常见的特有疾病，严重威胁母婴健康，目前缺乏精准的检测标准，因此，深入研究PE的发病机制，找到能实现早期诊断及有效治疗的分子靶标有着重要意义。CircRNA的报道[4]从1990年代初开始，由于技术水平的制约，近几年才成为研究热点。CircRNA可通过多种方式发挥其生物学功能，而了解较全面的是其能够作为 miRNA 海绵竞争内源性RNA，从而参与疾病的发病机制中。有研究小组提出并验证了心脏相关的circRNA可作为内源性miR-223海绵来抑制miR-223活性，促进心肌细胞肥大与凋亡，或作为miR-7a海绵，通过降低miR-7a的活性和提高miR-7a靶标的表达来促进心肌梗死的发展,从而参与心血管疾病的发生[5-6]。Wang et al[7]发现circRNA可抑制miR-7导致其不能诱导任何胰腺β细胞增殖，从而引起糖尿病发生。此外，circRNA还与肿瘤、神经系统疾病、肝炎等疾病的发生有关[8]。

然而，有关circRNA在妇产科疾病中的作用研究甚少。此次研究分析了circRNA在PE患者和正常妊娠妇女胎盘组织中的表达水平，发现44个circRNA在实验组中高表达，45个circRNA低表达。这89个circRNA中有75个circRNA与has-let-7家族成员有结合位点，且大多数还可以和miR-100或miR-101、miR-103家族成员结合。

Let-7 是一种低氧反应型miRNA，在缺氧条件下，let-7 的表达增加，通过相关的调控通路，调节机体的适应能力，维持机体正常的生理状态。Let-7与内皮细胞的很多生物学过程密切相关，如促进炎症反应发生、抑制细胞免疫应答，增强内皮通透性影响血管形成，参与细胞增殖与凋亡、调节脂质代谢[9]，还可通过调控Ⅲ型转化生长因子-β受体3来影响细胞的迁移和侵袭能力[10]。Let-7在PE患者胎盘中高表达，上调的Let-7可以通过靶向调控ephrin-B2/Eph 受体B4系统影响滋养细胞侵袭过程，从而加速PE进程[11]，说明let-7家族成员在PE中的异常表达可能与PE的病理过程存在一定相关性。

有研究[12-13]显示miR-100、miR-101、miR-103在PE患者胎盘组织中表达水平低于正常妊娠妇女。MiR-100被认为是一种新型上皮-间质转化诱导物，可诱导上皮- 间质转化过程，但它又能抑制肿瘤发生、迁移和侵袭。如miR-100通过靶向HOXA1抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭[14]。MiR-100-5p可以通过环氧化酶2抑制血管生成[15]。此外，Cao et al[16]发现miR-100可通过靶向CXCR7抑制癌细胞增殖。PE 过程中伴随着胎盘滋养细胞凋亡数的增加，有研究表明干扰miR-101 表达后凋亡细胞数量显著增加。进一步实验发现miR-101在内质网应激期间参与调节一些凋亡蛋白，通过在PE中靶向内质网蛋白44来调节滋养层HTR-8 / SVneo细胞的凋亡过程[13]。MiR-103是一种原癌基因，过表达的miR-103a通过下调p57来激活mTOR通路，进而促进细胞的增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡[17]。

因此，circRNA可能通过与let-7、miR-100、miR-101以及miR-103结合，抑制其生物学功能，从而参与到PE的发病机制中。 但是，circRNA如何通过调控miRNA来影响PE的发生发展，其具体机制还有待进一步的研究。当然，此次研究也存在很多不足之处。① 实验样本量过少，代表性不够，后续研究还需扩大样本量来加以论证；② 样本来自同一地区，可能有地域性差异。

综上所述，胎盘组织circRNA表达的失调可能与PE发病和病理生理过程有关。本研究为深入了解PE的发病机理提供了新的线索，并为改善PE的预防与诊疗水平提供了理论与实验依据。