MAIT细胞在结直肠癌患者外周血中频率、表型及功能改变

邵春艳，朱 云，仲 飞，2，王 华，3，4

黏膜相关恒定T (mucosal-associated invariant T, MAIT) 细胞是一种类先天样T淋巴细胞[1]，表达半恒定的T细胞受体 (T cell receptor, TCR)，其发育依赖于主要组织相容性复合体 (the major histocompatibility complex, MHC) Ib 类分子相关蛋白1 (MHC class I-related protein 1, MR1)[2]。该细胞可被维生素B代谢产物等激活[3]，活化后产生多种促炎及免疫调节细胞因子，间接调节着各种免疫，包括肿瘤免疫[4]。如MAIT细胞产生的IFN-γ可激活NK细胞、T细胞等，从而间接促进抗癌作用[5]。此外，其表面表达的C型凝集素NKG2D在肿瘤的免疫监视中也同样发挥着重要的作用[5]。

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展与肿瘤及肿瘤浸润的淋巴细胞也有密切的关系[6]。MAIT细胞是近来广受关注的一类免疫细胞，在临床疾病中亦有研究[7]。现选取结直肠癌患者，对其外周血循环MAIT细胞进行研究，探讨结直肠癌患者与正常健康者对比，外周血MAIT细胞频率、表型及功能的变化，化疗前后MAIT细胞频率有无改变，以及外周血MAIT细胞频率与临床肿瘤分期之间的关系。

1 材料与方法

1.1 外周血样本的获取样本为肝素化人外周血约2 ml，取自安徽医科大学第一附属医院体检中心的49例健康供者，年龄36～87 (58.40±1.76) 岁，排除肝肾心脑等重要器官疾病，排除自身免疫性疾病、恶性肿瘤，及近期无发热、无感染等病史的健康体检者，和已确诊的51例结直肠癌患者，年龄38～79 (60.17±1.68) 岁。

1.2 PBMC的制备将按等倍体积稀释的人外周血样本缓慢平铺于4 ml的人外周血淋巴细胞分离液 (Ficoll液)上，以转速2 000 r/min，25 ℃，30 min离心；巴氏吸管从已经分层的样本中，缓慢吸取云雾状白膜层，即为单个核细胞层，并用1×PBS溶液洗涤2遍，即得PBMC。本研究已通过安徽医科大学第一附属医院伦理委员会的批准。

1.3 主要试剂和仪器人系列单克隆荧光抗体 FITC-CD3(OKT3), PE-TCR/γδ(B1), APC- TCRVα7.2(3C10), Brilliant Violet 605-CD161(HP-3G10), Brilliant Violet 421-PD1(EH12.2H7), PE-CD69(FN50), APC/Cy7-Tim-3(F38-2E2), PE/Cy7-IFN-γ(B27), Brilliant Violet 421-TNF-α(MAb11). 所有流式抗体购自美国 Biolegend公司；Ficoll液(P8610) 购自北京Solarbio公司；PMA(P8139)、离子霉素(407951)购自美国Sigma公司；莫能霉素(420701)购自美国Biolegend公司；BD FACS流式细胞仪购自美国BD (Becton, Dickinson and Company)公司；检测所得数据通过流式分析软件FlowJo_V10进行数据分析。

1.4 MAIT细胞频率的检测及数据获取将制备好的PBMC用移液枪依次加入标记好的5 ml离心管内，加入小鼠血清20 μl封闭细胞表面Fc段，防止非特异性结合；再按实验方案加入预先制备的细胞表面检测荧光抗体、同型对照荧光抗体及单染色荧光抗体，避光，置于4 ℃环境，30 min进行标记，最后用1×PBS溶液洗涤后上机检测，并在检测前用单染色管调整至最佳的检测电压及补偿值。通过逐步圈门，计算出MAIT/CD3+T 细胞的比例 (%)；收集临床血常规信息，进一步计算出每ml全血MAIT细胞的绝对数 (×104/ml)。诸多关于MAIT细胞研究的报道，外周血MAIT细胞可定义为CD3+γδ-CD161++Vα7.2+ T细胞[6-8]，本文亦采取相同的圈门策略。

1.5 MAIT细胞功能检测将制备好的PBMC用1×PBS溶液洗1遍，用完全培养基重悬后，依次加入24孔培养板，每个培养孔体系控制在细胞数量1×106/ml，体积1ml；并向孔内加入刺激剂PMA、离子霉素及蛋白转运阻断剂莫能霉素，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内进行4 h的细胞刺激。刺激完成后，依次进行细胞外染色、胞膜固定、破膜及细胞内因子染色等步骤，最后以300 μl重悬液上机检测。并注意在设门时，淋巴细胞群位置的变化。

2 结果

2.1 结直肠癌患者外周血MAIT细胞的频率和绝对数降低如图1 (A4)所圈出的即为MAIT细胞。图1B为外周血MAIT细胞占CD3+T 细胞的比例以及全血中MAIT细胞绝对数在结直肠癌组及健康对照组之间的水平比较；流式结果显示与健康对照组相比，结直肠癌患者外周血MAIT细胞的比例 (图1B1，t=1.40±0.13/1.97±0.21，P=0.022)和绝对数 (图1B2，t=1.23±0.13/2.23±0.24，P<0.001)均降低。

2.2 化疗因素对结直肠癌患者外周血MAIT细胞频率的影响共8例患者，对同一患者化疗前后共收集2次不同的血样本，并进行MAIT细胞频率的相关检测。由图可以看出，化疗前后外周血MAIT细胞的频率变化无统计学差异，即化疗基本不影响结直肠癌患者外周血MAIT细胞频率的变化 (图2A：t=1.23±0.26/1.03±0.15，P=0.507；图2B：t=0.28±0.06/0.26±0.04，P=0.743)。

图1 流式细胞术对人外周血MAIT细胞的检测及结直肠癌组与正常对照中MAIT细胞频率的变化情况

A: 显示MAIT细胞的圈门策略，将外周血MAIT细胞定义为CD3+γδ-CD161++Vα7.2+ T细胞；B:结直肠癌患者外周血MAIT细胞的变化情况；与健康对照组比较：*P<0.05,***P<0.001

图2 化疗前后外周血MAIT细胞的比例和绝对数的变化

A：MAIT/CD3+T 的比例；B：每ml全血MAIT细胞的绝对数(×104/ml)

2.3 结直肠癌患者MAIT细胞相关重要免疫表型的变化情况MAIT细胞表面存在多种表型，除常规的CD4、CD8等分子外，还有一些与肿瘤免疫密切相关的分子，如PD-1、Tim-3、CTLA-4等；另外，其活化性分子有CD69和CD38。本文，我们选取其中部分表面分子进行含量测定 (n=16/16)。结果发现与健康对照组相比，结直肠癌患者外周血MAIT细胞表面的PD-1分子 (图3B左，t=4.97±0.63/3.24±0.56，P=0.049) 和CD69分子 (图3B中，t=27.83±2.40/14.07±1.88，P<0.001) 的测定是有差异的，但Tim-3分子(图3B右，t=4.10±0.52/4.38±0.78，P=0.757) 无变化；即结直肠癌患者外周血PD-1+ MAIT、CD69+ MAIT比例是升高的，但Tim-3+ MAIT细胞比例无变化。

2.4 经刺激活化后MAIT细胞功能的变化将制备好的PBMC用完全培养基重悬，加入24孔培养板，每孔加入PMA 0.5 μl、离子霉素1 μl和莫能霉素1 μl；再对刺激后的细胞进行胞膜固定、破膜处理，加入相应抗体；最后上机检测。流式结果显示与健康对照组相比，结直肠癌患者外周血MAIT细胞中IFN-γ+ MAIT细胞的水平 (图4B左，t=51.69±7.29/58.12±7.38，P=0.545)和TNF-α+MAIT细胞的水平均无明显变化(图4B右，t=38.56±3.49/47.98±4.33，P=0.121)。说明结直肠癌患者外周血MAIT细胞的功能基本无改变。

图3 两组表面分子PD-1、CD69及Tim-3 的测定

A:阴性区的界线，与阳性区的圈门位置；B:两组PD-1+、CD69+ 及Tim-3+ MAIT细胞的比例情况；与健康对照组比较：*P<0.05,***P<0.001

图4 结直肠癌患者外周血MAIT细胞功能的测定

A:显示圈门策略，纵、横坐标阳性区分别表示IFN-γ+与TNF-α+ MAIT细胞的比例；B:分别显示两组MAIT细胞经刺激后胞内IFN-γ和TNF-α的表达水平

2.5 结直肠癌患者外周血MAIT细胞的频率与其肿瘤分期之间的关系对于所收集的结直肠癌患者临床肿瘤分期的数据，我们将其分组，并比较Ⅱ～Ⅲ期与Ⅳ期肿瘤患者外周血中MAIT细胞频率和绝对数的差异。然而并无阳性结果 (图5 A：t=1.64±0.24/1.32±0.16，P=0.261；图5B：t=1.49±0.22/1.10±0.17，P=0.173)。肿瘤标志物在肿瘤的诊断及预后中也很有价值，根据其正常值范围均将患者分为两组，比较后发现差异也无统计学意义，见表1。

图5 外周血MAIT细胞频率与患者临床肿瘤分期之间的关系

3 讨论

MAIT细胞又是一类重要的免疫细胞，在人外周血中占1%～10%[4]，在肿瘤免疫中也扮演着重要的角色。我们想了解MAIT细胞在肿瘤免疫、肿瘤发生发展及肿瘤治疗中的价值，故此我们初步探讨了其最基本的生物学特性，即所呈现的频率、表型及功能有无变化。本研究显示：结直肠癌患者外周血MAIT细胞频率与绝对数低于健康对照组，这与之前关于肿瘤患者外周血循环MAIT细胞频率降低的研究结果相一致[9]。对于其重要表型的研究是本文一个新的研究思路，我们选取了T 细胞活化性表面标志分子CD69及免疫表型PD-1分子和Tim-3分子进行定量检测，发现其中PD-1分子和CD69分子的表面含量与对照组比是有变化的。但MAIT细胞在功能研究上却无明显差异，这可能是由于MAIT细胞的刺激实验成功率较低，只有6～8例左右的数据，若增加样本量可能还会呈现其他不同的结果。其次，化疗前后，结直肠癌患者外周血MAIT细胞频率与绝对数无变化，这与我们前期的另一项实验胃癌中MAIT细胞的研究结论也较为一致，即化疗不改变外周血MAIT细胞的频率。最后，MAIT细胞频率、绝对数与临床肿瘤分期也无关联，与肿瘤标志物CEA、CA19-9及CA72-4亦无关联。

表1 临床肿瘤标志物的水平与MAIT细胞外周血频率之间的关系

本研究的不足之处是通过流式检测对于人外周血MAIT细胞进行测定的研究方法过于单一。但研究方向、思路及内容可为后续肿瘤免疫的研究提供一些帮助。另外，对于组织中MAIT细胞的研究、外周血MAIT细胞的纯化、MAIT细胞与癌株的共培养实验，以及细胞因子在肿瘤免疫中的具体调节机制的探索将会是一些很有价值的研究方向。