丙戊酸钠对肺腺癌细胞的增殖、迁移能力的影响

代丽丽，束 军, 朱 宁，张 梅，沈继龙

癌细胞在有氧条件下能加速葡萄糖消耗，增加乳酸积累，这种现象被称为有氧糖酵解[1]，可刺激关键酶如乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)等的合成增加，在多种肿瘤中发现了异常的LDH表达[2-5]，抑制LDH可以抑制肿瘤的进展[4，6]。丙戊酸钠(sodium valproate,VPA)在多种癌症中发挥抗癌作用,VPA可抑制肝癌细胞的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[7]，VPA通过抑制有氧糖酵解抑制神经母细胞瘤的进展[8]，然而，VPA与肺腺癌PC9细胞的研究鲜有报道，与其有氧糖酵解及EMT的关系尚不清楚，该实验旨在研究VPA是否能抑制PC9细胞的增殖迁移能力及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验主要试剂与仪器人肺腺癌PC9细胞购自上海生命科学院；酶联免疫检测仪购自美国Biotek公司；VPA购自大连美仑生物技术有限公司；CCK-8试剂盒(c0039)、胰酶购自上海碧云天生物技术有限公司;胎牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司；DMEM低糖培养基购自美国HyClone公司；LDH试剂盒(A020-1-2)、LD试剂盒(A019-2)购自南京建成生物工程研究所;人E-钙黏蛋白(E-cadherin，E-cad)ELISA 试剂盒(CSB-E04519h)、人波形蛋白(vimentin，VIM)ELISA 试剂盒(CSB-E08982h)购自武汉华美生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 用DMEM低糖培养基常规培养人肺腺癌PC9细胞，用37 ℃、5% CO2的细胞培养箱，胎牛血清的浓度为10%，细胞呈贴壁生长，每2～3 d传代1次。

1.2.2CCK-8法检测VPA对PC9细胞增殖能力的影响 待细胞密度达到5×104个/ml时，在96孔培养板的每孔中加入100 μl细胞悬液，细胞贴壁后，加入2 ml含不同浓度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)的培养基，每组设5个复孔。分别作用24、48 h后，每孔加入10 μl CCK-8试剂，调整酶联免疫检测仪波长为450 nm,分别于0.5、1、2、3、4 h检测吸光度(optical density，OD)值。计算各组增殖抑制率，抑制率(%)=[1-实验组OD值]/对照组OD值×100%，实验均重复3次。

1.2.3用划痕实验检测VPA对PC9细胞体外迁移能力的影响 在6孔板背面每隔0.5～1 cm划一条横线，加入PC9细胞，待细胞长满时用200 μl枪头垂直于横线划痕。弃原培养基后，加无血清的培养基，使用显微镜拍照，为0 h的划痕宽度，弃无血清培养基，加入2 ml含不同浓度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)的培养基，24 h后使用倒置显微镜在和0 h拍照位置同样的位置拍照，用Image-pro plus 6.0软件计算迁移距离，迁移距离=0 h距离-24 h距离。

1.2.4乳酸脱氢酶活性检测试剂盒检测VPA对LDH活性的影响 将PC9细胞接种于6孔板，浓度调整为2×105个/ml，待细胞密度约60%～70%后，弃原培养基，加入2 ml含不同浓度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)的培养基，24 h后弃去培养液，消化离心，将离心后的细胞加入裂解液，室温放置1 h后将其置于-80 ℃冰箱15 min，后迅速放入37 ℃水浴锅5 min，反复操作3次。后放入离心机离心，将上清液移至EP管中备用。按照LDH测试盒说明书中的操作步骤分别进行加样后，用酶联免疫检测仪在波长为440 nm时测定OD值，计算出LDH活性，计算公式为：LDH活性=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD-空白OD值)×标准品浓度(2 mmol/L)×N×1 000(N为样本稀释倍数)。

1.2.5乳酸定量试剂盒检测VPA对LD生成量的影响 将PC9细胞接种于6孔板，浓度为2×105个/ml，待细胞贴壁密度60%～70%后，弃原培养基，加入2 ml含不同浓度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)的培养基，24 h后，将上清液离心，离心机参数为4 ℃、3 000 r/min，离心20 min，将上清液备用。按照LD测试盒说明书中的操作步骤分别进行加样后，用酶联免疫检测仪在波长为530 nm时测定OD值，计算出LD生成量，计算公式为：培养液中的乳酸含量(mmol/L)=(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(3 mmol/L)×样本测试前稀释倍数。

1.2.6人E-cad及VIM酶联免疫吸附测定试剂盒检测细胞上清液及细胞内E-cad及VIM的浓度 按1.2.4及1.2.5方法制备待测样本后，按照酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒说明书进行操作后用酶联免疫检测仪在450 nm 波长依序测量各孔的OD 值，计算出蛋白含量，计算方法为：以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数。

2 结果

2.1 VPA抑制PC9细胞的增殖CCK-8法检测结果显示，不同浓度的VPA分别干预24、48 h后，实验组与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。在同样的作用时间，VPA浓度越大，其对PC9细胞的增殖抑制率越高，差异有统计学意义(P<0.05)；在同样浓度的VPA作用下，VPA作用时间越长，其对PC9细胞的增殖抑制率越高，差异有统计学意义(P<0.05)。24 h时(F=162，P<0.05)；48h时(F=145，P<0.05)。综上，VPA对PC9细胞的增殖抑制作用有浓度依赖性和时间依赖性，见图1。

图1 VPA对PC9细胞抑制率的影响

与0 mmol/L对照组比较：*P<0.05；与2 mmol/L实验组比较：#P<0.05；与4 mmol/L实验组比较：&P<0.05；与8mmol/L实验组比较:★P<0.05；与24 h比较：▲P<0.05

2.2 VPA抑制PC9细胞的迁移与对照组比较，VPA浓度越高，迁移距离越少，各实验组间差异有统计学意义(F=133，P<0.05)，见图2。

2.3 VPA抑制LDH活性不同浓度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)作用24 h后，VPA浓度越高，LDH活性越低，0、2、4、8、16 mmol/L每两组之间比较差异均有统计学意义(F=157，P<0.05)。见表1。

2.4 VPA抑制LD生成不同浓度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)作用于细胞24 h后，VPA浓度越高，乳酸生成量越低，0、2、4、8、16 mmol/L每两组之间比较差异均有统计学意义(F=289，P<0.05)。见表1。

图2 VPA对PC9细胞迁移能力的影响 ×100

A：对照组；B～E： VPA 2、4、8、16 mmol/L；1：0 h；2：24 h；与0 mmol/L对照组比较：*P<0.05；与2 mmol/L实验组比较：#P<0.05；与4 mmol/L实验组比较：&P<0.05；与8 mmol/L实验组比较:★P<0.05

表1 不同浓度的VPA分别干预PC9细胞对其LDH活性、LD生成量、上清液及细胞内E-cad、VIM的影响

与0 mmol/L对照组比较：*P<0.05；与2 mmol/L实验组比较：#P<0.05；与4 mmol/L实验组比较：&P<0.05；与8 mmol/L实验组比较:★P<0.05；与上清液中E-cad含量比较：■P<0.05;与上清液中VIM含量比较：▲P<0.05

2.5 VPA促进E-cad生成不同浓度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)作用于细胞24 h后，VPA浓度越高，E-cad含量越高，0、2、4、8、16 mmol/L每两组之间比较差异均有统计学意义，上清液中E-cad含量(F=235，P<0.05)，细胞内E-cad含量(F=268，P<0.05)。见表1。

2.6 VPA抑制VIM生成不同浓度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)作用于细胞24 h后，VPA浓度越高，VIM含量越低，0、2、4、8、16 mmol/L每两组之间比较差异均有统计学意义，上清液中VIM含量(F=180，P<0.05)，细胞内VIM含量(F=149，P<0.05)，见表1。

3 讨论

在所有癌症中，肺癌的发病率和死亡率均居前列。在2019年180万新发癌症病例中，肺癌占12.9%，占癌症相关死亡病例的19.4%[9]。既往已有的治疗方式很多，但患者的预后仍需进一步改善。新开发药物需要耗费很多的财力和时间，探索已有的药物是否有抑制肿瘤作用成为一个新的方向。

VPA作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)，已被广泛应用于治疗癫痫症等疾病。组蛋白去乙酰化酶通过组蛋白的去乙酰化，使DNA更紧地缠绕在组蛋白上，导致与细胞分化、细胞周期阻滞等蛋白的表达受到抑制引起癌症，HDACIs能恢复这些癌症抑制因子的表达达到抑制肿瘤的目的[10]。VPA可以抑制多种癌症的发展，Xu et al[11]证明VPA诱导甲状腺癌细胞凋亡和自噬，Fanian et al[12]证明 VPA通过抑制MMP-2抑制甲状腺癌细胞的迁移和侵袭，Fang et al[8]证明VPA通过抑制有氧糖酵解抑制神经母细胞瘤的进展。但VPA与PC9的相关研究目前鲜有报道，本研究旨在探讨不同浓度VPA对肺腺癌PC9细胞增殖、迁移能力的影响及可能的机制。结果表明，不同浓度的VPA可以抑制PC9细胞的增殖和迁移,VPA浓度越高，抑制作用越明显，同时与对照组相比，VPA浓度越高，LDH活性及LD生成量越少，说明VPA抑制了有氧糖酵解。VPA对PC9细胞的增殖和迁移的抑制与对有氧糖酵解的抑制呈现一致性，提示VPA有可能通过抑制有氧糖酵解途径抑制PC9细胞的增殖和迁移。

EMT在肿瘤细胞发生侵袭和转移时发挥重要的作用，EMT的标志物很多，其中上皮标志物E-cad和间质标志物VIM较为典型，发生EMT时，E-cad含量降低，VIM的含量增高[13]，本研究中，ELISA的结果表明，随着VPA浓度增加，实验组细胞培养上清液中和细胞内E-cad蛋白浓度均逐渐增高，VIM蛋白浓度均逐渐降低，这表明VPA可以抑制EMT的进展，这与许多研究[4，12]结果相符。

Hou et al[2]在肺癌中检测到LDH高表达，敲低肺癌细胞中的LDH-A可抑制癌细胞的增殖、侵袭，且敲低前后E-cad的表达水平上调，而VIM的表达水平下调，证明了LDH可以调节EMT，同样的Jiang et al[4]证明膀胱癌中检测到LDH高表达，敲低LDH后，VIM、N-cad、snail下调，而E-cad上调，表明抑制LDH抑制EMT，与之一致，由此笔者猜想VPA可能是通过抑制LDH活性来抑制EMT从而抑制肺癌细胞的增殖、迁移，其中的机制仍然需要进一步的研究。

综上所述，本实验表明VPA可以抑制PC9细胞的增殖、迁移，但是VPA在体内的抗肿瘤作用、对正常支气管上皮细胞的影响及具体的作用机制仍需进一步的研究。