基于CRISPR-Cas9技术构建gpr41基因敲除的RAW264.7细胞系

苏 丛，徐方明，伍 婷，张鹏飞,，陈昊然，刘艳艳,,4，兰燕虎，李家斌,,,4, 律 娜

CRISPR-Cas9基因敲除策略是目前最便利的一种基因编辑技术，其原理是将tracrRNA(trans-activating crRNA)和crRNA(CRISPR RNA)整合成一个复合体，即tracrRNA/crRNA复合体，一种具有引导功能的向导RNA (guide RNA, gRNA)；利用外源表达Cas9蛋白与人工设计的gRNA形成蛋白核酸复合物。其中，gRNA 5'端与靶DNA的20个核苷酸特异性结合，3'端可以结合并激活核酸内切酶Cas9，引导Cas9对DNA进行定点切割，从而实现对目的基因的特异性剪切[1]。

巨噬细胞广泛分布于人和动物体内，是一种重要的固有免疫细胞[2]。短链脂肪酸 (short-chain fatty acid, SCFAs)主要是肠道微生物群发酵的产物，可以抑制中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞中促炎因子的产生，具有抗多种炎症性疾病的治疗潜力[3-4]。G-蛋白偶联受体41(G protein-coupled receptor 41, GPR41)在中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞、淋巴细胞上均有表达。一般认为，GPR41和GPR43的激活以及组蛋白去乙酰化酶的抑制是SCFAs抗感染作用的基础[5-6]。现利用CRISPR-Cas9技术构建gpr41基因敲除的巨噬细胞系，为进一步探讨gpr41基因在巨噬细胞中的功能及机制研究提供细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株、菌种和质粒 小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞与HEK293T细胞由安徽省细菌耐药性监控中心保存；感受态细胞DH5α由安徽省细菌耐药性监控中心保存；真核表达载体pLenticrisprV2及pMD2.G、psPAX2慢病毒载体包装质粒均购自优宝生物科技有限公司(上海)。

1.1.2材料与试剂 Bsmb I限制性内切酶、T4 PNK、T4 DNA连接酶、酶切缓冲液均购自美国New England Biolabs公司；脂质体2000(Lipofectamine 2000)购自美国Invitrogen公司；高糖DMEM细胞培养液及胎牛血清均购自美国Gibco公司；胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司；GPR41抗体购自英国Abcam公司；二抗山羊抗IgG/辣根酶标记购自北京中杉金桥公司。引物和测序均由通用生物系统(安徽)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 37 ℃水浴复苏小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞和HEK293T细胞，转移至T25培养瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱中。

1.2.2gRNA的设计和寡链核苷酸的合成 利用在线设计工具(http:∥www.rgenome.net/casdesigner/)，根据CRISPR/Cas9靶点设计原则，设计了靶向gpr41外显子3的上下游的3对gRNA，分别命名为gRNA1、gRNA2、gRNA3。详见表1。

1.2.3构建含有gRNA的重组质粒载体 BsmbI酶切pLenticrisprV2质粒，酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。见图1。根据胶回收试剂盒说明书切胶后回收并纯化，测定DNA浓度(大约50 ng/μl)。随后将切胶后回收的DNA质粒与退火形成双链的gRNA混合，加入T4连接酶，室温过夜连接。将连接产物转化至 DH5α感受态细胞，通过氨苄抗性平板涂板筛选，挑取单菌落至氨苄抗性(100 mg/ml)的LB肉汤培养基中过夜扩大培养，提取质粒后，送公司测序鉴定，将构建成功的重组质粒命名为pLenticrisprV2-gpr41-gRNA。并将获取的正确的质粒分别命名为GPR41-gRNA1、GPR41-gRNA2和GPR41-gRNA3质粒。

1.2.4慢病毒包装与细胞转染 取1 μg pLenticrisprV2-gpr41-gRNA质粒、750 ng的psPAX2质粒和250 ng的pMD2.G混匀，加入Lipofectamine 2000 5 μl，室温放置25 min后病毒包装辅助质粒共转染HEK293T细胞，48 h后收集HEK293T细胞的培养基，2 000 r/min、4 ℃离心10 min，吸取上清液并用0.45 mm过滤器纯化病毒，于-80 ℃保存。取对数生长期的RAW264.7细胞，制成单细胞悬液，接种在6孔培养板中，细胞密度以铺满40%板面的饱和度适宜。细胞贴壁后，将纯化的病毒呈梅花状加至RAW264.7中，同时按1 ∶1 000的比例加入Polybrene，帮助病毒进入细胞，1 h后更换新鲜培养基。第2天换液并用1×PBS洗2次，加入新鲜培养基。第3天起用含有嘌呤霉素的培养液继续培养2 d，每天以相同浓度进行换液培养，杀死未转染成功的细胞，用等量的空白质粒做阴性对照。

1.2.5筛选稳定敲除细胞株 经嘌呤霉素筛选存活的细胞即为可能成功转入pLenticrisprV2-gpr41-gRNA质粒的细胞。经胰酶消化后稀释，接种至96孔板进行培养，每孔3～5个细胞。继续培养10 d后，挑单克隆细胞至24孔板继续培养。

1.2.6Western blot检测基因稳定敲除细胞系 当细胞长满24孔培养板时，取部分细胞用RIPA裂解液提取蛋白，每个样取30 μl和上样缓冲液混合后金属浴煮沸10 min变性，制备蛋白样品后进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将蛋白转至经甲醇浸泡数分钟且适当大小的PVDF膜上，冰上转膜1～2 h后用5% 脱脂奶粉室温封闭1 h。用β-actin抗体(1 ∶5 000)和GPR41抗体(1 ∶500)于4 ℃冰箱中过夜孵育，之后用洗脱液漂洗3次，再用相应的山羊抗兔或山羊抗鼠的二抗(1 ∶10 000)孵育2 h，洗脱3次后用成像系统进行扫描，观察GPR41蛋白是否表达，以判断gpr41基因是否敲除成功。

2 结果

2.1 gRNA寡链核苷酸的合成结果按照CRISPR/Cas9靶点设计原则，利用在线设计工具设计3对gpr41 gRNA上下游引物序列，见表1。

表1 gpr41 gRNA序列

2.2 pLenticrisprV2质粒酶切产物琼脂糖凝胶电泳鉴定利用琼脂糖凝胶电泳的方法检测pLenticrisprV2质粒是否被酶切开，电泳结果显示，对照组仅有一条没有切开的条带，而酶切成功的质粒在相应位置出现两条明显的亮条带，见图1。

图1 pLenticrisprV2质粒酶切图

2.3gpr41基因敲除验证选择野生型细胞系和敲除型细胞系在蛋白水平上检测GPR41表达情况。

图3 gpr41基因敲除RAW264.7细胞系的单克隆测序

Western blot结果显示，野生型细胞中GPR41蛋白正常表达，而敲除型细胞中检测不到GPR41蛋白的表达(图2)。

图2 GPR41蛋白水平检测

2.4 单克隆测序检测gpr41基因将gpr41基因中gRNA敲除靶点核苷酸序列测序(图3)。gpr41基因缺失9个碱基，造成gpr41基因突变，证明对细胞进行了成功敲除。

3 讨论

巨噬细胞是形成先天免疫系统的骨干，几乎存在于每一个组织中，在维持组织的稳态和协调细胞对组织损伤的反应中起着至关重要的作用[7-8]。

GPR41表达于巨噬细胞、T细胞上，是SCFAs的受体蛋白。SCFAs是肠道微生物群发酵的最终产物，在减轻炎症和改善宿主代谢方面发挥作用,是宿主重要的能量来源。SCFAs结合并激活GPR41，抑制cAMP的产生和ERK的级联激活[9]。此外，SCFAs对T细胞的直接作用可以在自身免疫性脑炎中促炎，而缺乏GPR41的小鼠对自身免疫性脑炎发病机制更具抗性[10]。可见，短链脂肪酸及其受体对机体具有一定的保护作用。

本实验利用CRISPR-Cas9技术，通过慢病毒转染，首先使RAW264.7细胞可以稳定表达Cas9蛋白。通过凝胶电泳和测序结果可以看到，gRNA已成功连接到pLenticrisprV2载体上，证明已成功构建了pLenticrisprV2-gpr41-gRNA载体。通过Western blot及核苷酸测序结果可以看出，经过脂质体转染后，RAW264.7细胞中GPR41蛋白已不再表达，说明gpr41基因已经被敲除。GPR41是将SCFAs与巨噬细胞相联系的桥梁之一，但gpr41基因在巨噬细胞中的作用机制并不十分明确，且SCFAs能否通过gpr41调控巨噬细胞相关反应以及gpr41基因敲除之后对巨噬细胞系功能的影响均不清楚，仍需进一步的研究探索。采用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建的gpr41基因敲除巨噬细胞模型更有利于探索以上科学研究。