肝细胞癌中膜铁转运蛋白的表达及意义

王珊珊，汪 静，张 浩，王 琴，杨 凯，管世鹤

肝癌是全球病死率最高的恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的第二大原因[1]，特别是在发展中国家。在我国每年有近38万人死于肝癌，面对如此严峻的形势，肝癌的治疗备受关注。铁是人体必不可少的微量元素之一，在人体中参与腺嘌呤核苷三磷酸 (adenosine triphosphate，ATP)的合成，氧的运输及DNA合成等多种代谢过程，而膜铁转运蛋白(ferroportin，FPN)作为唯一已知的铁离子输出蛋白，在体内广泛分布，是参与机体铁代谢的重要调节因子。已有研究[2- 3]表明，铁代谢紊乱引起的过量铁离子与肿瘤的发生，转移及预后有关。该研究拟通过分析FPN在肝细胞癌中表达及与患者的分期和预后的关系，阐明FPN可能在肝细胞癌的发生发展起到的作用，为肝细胞癌的免疫治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集2017年3月～2019年3月安徽医科大学第二附属医院检验科血清169例。肝癌组80例，慢性肝病组48例，健康对照组血清41例。肝癌组男58例，女22例，年龄在28～86(52.61±13.61)岁；慢性肝病组男38例，女10例，年龄在27～75(47.40±11.17)岁；健康对照组男25例，女16例，年龄在16～80(48.98±14.30)岁。 收集2017年3月～2018年8月安徽医科大学第四附属医院病理科石蜡包埋的肝组织46例、肝癌组织32例、正常肝良性病变肝组织14例。肝癌组织男28例，女4例，年龄在39～70 (56.87±13.39) 岁。肝良性病变肝组织男6例，女8例，年龄在55～69(62.71±5.99)岁。所有受检人员性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义，且均未服用华法林抗凝剂、维生素K及维生素K拮抗剂等药物。

1.2 纳入标准和排除标准纳入标准： ① 所有肝癌患者均符合《原发性肝癌诊疗规范(2017版)》诊断标准；② 所有慢乙肝患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》诊断标准；③ 血清标本的选择均为受检者入院后第1次检测。排除标准：① 排除其他恶性肿瘤；② 排除其他肝脏病史如肝移植病史，转移性肝癌等。

1.3 主要仪器与试剂FPN抗体购自美国Abcam公司；普鲁士蓝铁染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；免疫组化试剂购自安徽欣乐生物技术有限公司；人膜铁转运蛋白ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物技术公司。奥林巴斯CR23显微镜观察免疫组化结果，Roche601电化学发光仪检测甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)， KHB-ST-360酶标仪读取FPN吸光度值，Siemens2000全自动生化仪检测丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)水平，Mindray6800血常规分析仪检测血红蛋白(hemoglobin，Hb)水平。

1.4 方法

1.4.1普鲁士蓝铁染色检测肝癌组织铁沉积 肝组织石蜡切片经二甲苯脱蜡两次，用不同浓度梯度的乙醇(100%、95%、90%、85%)水化。Perls stain染液染色15～30 min，蒸馏水充分冲洗5～10 min后，伊红染液复染15～30 s,蒸馏水冲洗3～5 s。最后乙醇(90%、95%、100%)脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。普鲁士蓝铁染色结果判断：无蓝色铁颗粒沉积为阴性，有蓝色铁颗粒沉积为阳性。

1.4.2免疫组化检测FPN在肝组织中的表达 将石蜡组织切片在二甲苯中脱蜡，并根据标准方案在降序乙醇系列中再水合。在0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液中在100 ℃下进行热诱导的抗原修复20 min。酶消化的抗原修复在0.1%胰蛋白酶中于37 ℃进行25 min。然后用血清封闭切片30 min，然后与兔抗SLC40A1抗体在37 ℃温育1～2 h。洗涤后，将切片与辣根过氧化物酶-山羊抗兔抗体在37 ℃温育30 min。用DAB缓冲底物中的3,3-二氨基联苯胺(DAB)溶液显色过氧化物酶反应。用DAB显示切片并用苏木精复染，安装在中性胶中并使用明视野显微镜分析。使用鼻咽癌病理切片作为阴性对照，并用PBS代替一抗。为了评估IHC结果，使用Image-J软件对免疫组化结果进行分析判读。

1.4.3ELISA检测FPN在肝癌患者和正常健康对照者血清中的表达 将标准品工作液与待测样品依次加入酶标板孔中每孔100 μl，覆膜，37 ℃孵育90 min；弃去液体不用洗涤，每孔直接加入生物素化抗体工作液100 μl，覆膜，37 ℃孵育60 min；甩尽孔内液体，每孔加入洗涤液350μl，浸泡1～2 min后拍干，重复洗涤3次；加入酶结合物工作液100 μl，覆膜，37 ℃孵育30 min，同上洗涤5次；每孔加入底物溶液90 μl，覆膜，37 ℃避光孵育15 min后加入终止液50 μl，终止反应，立即使用酶标仪在波长450 nm波长测量各孔OD值。

1.5 统计学处理采用SPSS 16.0统计软件进行分析,其中正态数据采用均数和标准差表示，偏态数据采用中位数和四分位数间距表示，正态分布数据比较采用t检验，偏态分布数据采用秩和检验，检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌患者肝组织中肝铁沉积普鲁士蓝铁染色结果显示，肝癌组织中铁沉积明显高于肝良性病变组织(图1)，肝癌组织出现明显的蓝色铁沉积，而肝良性病变组织中无蓝色铁颗粒，以上结果提示肝癌患者较对照组织中出现铁代谢紊乱，并发生肝铁沉积现象。

图1 HCC和肝良性病变组织普鲁士蓝铁染色 ×200

2.2 FPN在血清中的表达水平健康对照组、慢性肝病组和肝癌组生化指标水平比较中显发现ALT、AST、TBIL、Hb、FPN三组均有差异(表1)，且肝癌组患者血清中FPN表达水平明显高于健康对照组和慢性肝病组(图2)。再对肝癌患者进行临床特征分析，发现患者的Child-pugh肝功能分级(P<0.05)，BCLC肝癌分期(P<0.05)，转移(P<0.05)与FPN表达水平差异有统计学意义，与结节数目、肿瘤的大小(P>0.05)差异无统计学意义(表2)。

2.3 FPN在肝组织中的表达免疫结果显示，肝良性病变组织中细胞膜和细胞质中无明显的棕黄色染色，而肝癌组织细胞膜和细胞质中有明显的棕黑色染色(图3)，肝癌患者肝组织中FPN% Area中FPN(9.718±8.005)明显高于肝良性病变患者肝组织中FPN% Area (2.669±2.231)，差异有统计学意义(t=2.361,P<0.05)。

表1 健康对照组、慢性肝病组和肝癌组生化指标水平比较[M(P25,P75)]

与健康对照组比较：#P<0.05；与慢性肝病组比较：*P<0.05

图2 血清中FPN表达

与健康对照组比较：#P<0.05；与慢性肝病组比较：*P<0.05

表2 FPN与肝癌患者临床特征的相关性[M(P25,P75)]

图3 肝组织免疫组化染色

3 讨论

我国是肝癌大国，每年新发病例和死亡病例都占到全球的50%以上。据统计，我国的肝癌患者，以巴塞罗那分期B和C期为主，占到所有肝癌患者的80%以上，C期在我国肝癌患者中占到50%以上，大多数肝癌患者发现时即为晚期，而早期肝癌的诊出率不足30%，晚期肝癌的五年生存率不足20%，而及时进行规范治疗后，早期肝癌的5年生存率已超过70%[4]。因此，寻找有效的靶基因对肝癌的早期诊断早期治疗是尤为重要的。

人FPN基因位于2号染色体上，其mRNA编码的FPN有571个氨基酸，分子量约62 000，在体内广泛分布，在脾脏、肝脏、十二指肠、心脏等细胞中均有表达。肝脏中，FPN主要表达在枯否细胞的细胞质，肝细胞的窦周边缘[5]。FPN是机体铁代谢的重要调节因子，将细胞内游离铁转运至胞外，其变化会使肿瘤细胞更具侵袭性。因此，FPN异常引起的铁代谢失衡通常会引起肿瘤侵袭和转移。Geng et al[6]提出，敲低FPN可加速诱导神经母细胞瘤发生铁死亡。Shan et al[7]发现，抑制FPN表达可刺激三阴性乳腺癌细胞的增殖、EMT和迁移。Wang et al[8]发现FPN与肝癌预后有一定的相关性。薛冬 等[9]发现FPN在前列腺癌细胞株和患者癌组织中均低表达，可能与其参与铁调节相关，由此可见，FPN可能在肿瘤的发生发展中起到重要作用。

本研究首先通过普鲁士蓝铁染色发现肝癌患者肝组织中已出现铁沉积，表明肝癌患者体内已出现铁紊乱现象，再通过免疫组化与ELISA分析出肝细胞癌患者体内肝组织和血清中FPN的表达均高于对照组(P<0.05)，进一步分析患者的临床特征也得出FPN的表达程度与患者的Child-pugh肝功能分级，BCLC肝癌分期，转移呈正相关。这与Wang et al[8]研究得出的肝癌患者组织中FPN低表达相矛盾，一方面可能由于肝脏发生铁过载现象，机体反馈性的上调铁调素的分泌水平，而FPN是已知的哺乳动物唯一的铁输出蛋白，需铁调素结合，发挥作用，减少铁的吸收，细胞内释放铁离子至血液减少，改善体内的铁过载现象；另一方面，FPN在肝脏的亚细胞定位主要集中在枯否细胞胞质中，肿瘤细胞侵犯肝脏细胞时致使枯否细胞发挥吞噬和清除功能，FPN从胞质释放进入血清[10-11]，导致FPN在肝癌患者体内高表达。

综上所述，我们认为FPN在肝细胞癌的发生发展中起到重要作用，可作为肝细胞癌免疫治疗的一个新的靶点。其机制可能是FPN作为铁输出的重要调节因子， 其mRNA可被高水平的细胞内铁促进[11]，在肝细胞发生肿瘤时，细胞内铁含量增高，铁依赖的FPN表达增加，会将细胞内铁转移到细胞外，延缓细胞内铁超载，因此细胞内铁浓度升高会引发FPN补偿性的负反馈调节，有利于肝细胞内铁含量的稳定，从而保护组织免受铁超载的伤害[5]，而铁超载会使细胞内活性氧增加，可致肿瘤细胞发生铁死亡，然而铁死亡[12]作为一种新型的细胞死亡方式在肝细胞癌中起着重要作用[13-14]，FPN升高使得肝癌细胞逃避铁死亡。但是FPN参与肝癌细胞铁死亡的分子机制仍有待于研究。