桦褐孔菌有效破壁方法及其对免疫功能的影响

雷艳敏 黄常新 王聪洁 杨丽丽

桦褐孔菌又名桦树茸，是一种药用价值较高的食用菌菇，因其具有抗肿瘤［1］、抗衰老［2］、降血糖［3］、抗艾滋病病毒［4］等作用，在波兰、俄罗斯等地受到广泛应用［5］。日本研究者将其菌核作为艾滋病、肝癌和大肠杆菌感染的治疗剂，并申请了相关专利［6］。另外，在毒理研究方面，束庆玉等［7］发现桦褐孔菌无明显生理毒性。桦褐孔菌因其细胞壁的存在，阻碍其细胞壁内物质的释放。超声粉碎仪可以通过超声波将细胞壁结构破坏，有助于桦褐孔菌释放细胞内容物进而发挥生物学作用。目前所知桦褐孔菌的主要成分有桦褐孔菌多糖、黑色素、桦褐孔菌素［8］、木质素、桦褐孔菌醇等。已有研究发现其具有抗肿瘤［1］、抗氧化［9-10］、护肝［11］、增强免疫［10］、抗疲劳［12-13］、抗病毒［4］等作用，但其具体机制尚不明确。本文探讨桦褐孔菌对免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 桦褐孔菌购自大连高静贸易有限公司；JY96-IIN 超声波细胞粉碎仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司；LX 300 型微量离心机购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司；全自动酶标仪购自美国Bio-Rad 公司；Balb/c 小白鼠，8 周龄，雄性，体重（26.45±0.80）g 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；细胞培养箱购自施都凯仪器设备（上海）有限公司；光学显微镜购自尼康仪器（上海）有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、PBS、Hank's 液、RPMI-1640、96 孔培养板、CCK-8 试剂盒购自杭州市泽衡生物科技有限公司；TNF-αElisa 试剂盒、IL-2 Elisa 试剂盒购自联科生物科技有限公司；IL-17 Elisa 试剂盒、TGF-βElisa 试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；CT26、K562 细胞课题组液氮冻存。

1.2 桦褐孔菌破壁提取 取桦褐孔菌120g，分为4 组，每组30g 溶于600ml 蒸馏水，分别置于不同工作条件下的超声粉碎仪中粉碎制成溶液。见表1。

表1 各组桦褐孔菌破壁提取液超声粉碎仪工作条件

1.3 蛋白浓度测定 （1）依据BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明绘制标准曲线：按50 体积BCA 试剂A 加1体积BCA 试剂B（50 ∶1），配制适量BCA 工作液，充分混匀。完全溶解蛋白标准品，取10μl 稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品用PBS 液分别稀释至0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125、0mg/ml 取20μl 加入到96 孔板的标准品孔中。各孔加入200μl BCA 工作液，37℃放置30min。于550nm 处测定吸光度值，绘制标准曲线。（2）测定各组蛋白浓度：取各组桦褐孔菌水溶液离心（1000r/min，5min）取上清液，分别用PBS 液稀释至4、8、10、16、20、32 倍浓度，各取20μl 加入到96 孔板中，各孔加入200μl BCA 工作液，37℃放置30min。于550nm 处测定吸光度值。根据标准曲线方程计算出各组桦褐孔菌液蛋白浓度。

1.4 体外淋巴细胞增殖活性实验 鼠淋巴细胞悬液制备：（1）取8 周龄、体重26.5g 的Balb/c 雄鼠1 只，颈椎脱臼法处死，在75%乙醇溶液中浸泡5min；（2）将小鼠移入超净工作台内，无菌条件下，无菌取出脾脏，置于无菌培养皿中，剪去脂肪和筋膜组织，用Hank's液漂洗；（3）将脾脏放置200 目不锈钢网上，用注射器针芯碾压研碎，使单个细胞经网进入不锈钢筛网下面的RPMI-1640 培养液；（4）收集细胞悬液于离心管中，以1500r/min 离心机离心10min，弃上清液；加入2ml 0.83% Tris-NH4cl 溶液，静置5min 破坏红细胞，1500r/min 离心10min 收集细胞（见离心后所得为白色沉淀上方只有一层红色膜为最佳状态）；用RPMI-1640 培养液1000r/min 离心10min 洗涤细胞2 次以去除剩余NH4cl；（5）以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬脾细胞，37℃、5% CO2培养箱培养2h 以去除贴壁细胞，收集悬浮细胞作为脾淋巴细胞，调整细胞密度为2.5×108/ml。台盼蓝染色计数活细胞数>95%。将桦褐孔菌破壁水溶液、4 倍稀释桦褐孔菌破壁水溶液、PBS 分别和细胞悬液按1 ∶100 的比例混合，加入96 孔细胞培养板，同时设对应空白孔：桦褐孔菌破壁水溶液+培养液（1 ∶100 比例混合）、4 倍稀释桦褐孔菌破壁水溶液+培养液（1 ∶100 比例混合）、PBS 液+培养液（1 ∶100 比例混合），每组3 个复孔，常规培养3d 后，加入CCK-8 溶液10μl 继续培养4h，在酶联免疫检测仪上450nm 处各孔吸光值OD。增殖指数PI=（实验孔A 值-对应空白孔）/（对照孔A 值-对应空白孔）×100%。

1.5 荷瘤动物建模 取健康雄性BALB/c 小鼠16 只，体重（26.45±0.80）g，8 周龄，进行以下造模步骤：CT26 结肠癌细胞由本课题组保存。常规复苏和培养，收集对数生长期细胞，1000r/min 离心5min，再用无菌生理盐水洗涤细胞3 遍，重悬于无菌生理盐水中，制备细胞悬液5×106个/ml。取BALB/c 小鼠左侧后肢近端皮肤为注射点，常规75%乙醇溶液消毒局部皮肤，将5×106个/ml 细胞悬液100μl 注射至相应部位。继续常规饲养。

1.6 细胞因子测定 随机将荷瘤鼠分为2 组：桦褐孔菌组（8 只）、生理盐水组（8 只）；分别于接种CT-26细胞48h 后每天灌服桦褐孔菌破壁水溶液（0.015ml/g）、生理盐水（0.015ml/g），连续喂养达12d 时，眼静脉取血Elisa 法测IL-17、IL-2、转化生长因子β（TGF-β）、肿瘤坏死因子α（TNF-a）浓度。

1.7 NK 细胞杀伤活性测定 将荷瘤鼠无菌取脾，计算脾脏指数，脾脏指数=（脾脏重量/小鼠体重）×100%，并获得脾淋巴细胞悬液（步骤同1.4）作为NK 效应细胞，以K562 细胞作为靶细胞，测定NK细胞杀伤活性。具体方法：（1）脾淋巴细胞重悬于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液，调整密度为2×107个/ml 以备用；复苏K562 细胞，重悬于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液于细胞培养箱（37℃，5% CO2）培养24h 后，调整细胞密度为4×105个/ml，台盼蓝计数活细胞>95%；（2）在96 孔板中加入NK 细胞悬液、K562 细胞悬液各100μl，每个样品孔设3 个复孔，另设仅含靶细胞-K562 的自然释放孔和仅含效应细胞-NK 细胞的自然释放孔，以及靶细胞-K562 最大释放孔；（3）96 孔板置于37℃、5% CO2培养箱培养共4h，达3h 时在K562 最大释放孔加入10μl LDH释放试剂，反复吹打混匀，继续培养箱培养1h；（4）结束培养后，用多孔板离心机400g 离心5min，取上清液120μl 加入新的96 孔板相应孔中，放入酶标仪中测490nm 处吸光度；（5）计算细胞杀伤活性。细胞杀伤活性%=100×（E-ES-TS）/（TM-TS），E：杀伤检测孔OD 值；ES：效应细胞酶自然释放孔OD 值；TS：靶细胞酶自然释放孔OD 值；TM：靶细胞最大释放孔OD 值。

1.8 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计学软件。计量资料采用（±s）表示，两组间比较采用独立样本t 检验；多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 超声粉碎仪较佳工作条件选择 超声粉碎仪在设置功率55W，工作时间15min 时所得桦褐孔菌破壁水溶液的蛋白浓度最高。见表2。

表2 各组桦褐孔菌破壁提取液蛋白浓度比较［mg/ml，（±s）］

表2 各组桦褐孔菌破壁提取液蛋白浓度比较［mg/ml，（±s）］

注：与组4比较，*P<0.05

组别 超声粉碎仪工作条件 只 浓度功率（W） 时间（min）1 75 8 8 6.07±0.34 2 75 12 8 6.37±0.93 3 65 12 8 6.66±0.52 4 55 15 8 8.15±0.88

2.2 体外淋巴细胞增殖活性结果 桦褐孔菌破壁水溶液具有促进淋巴细胞增殖作用（P<0.05），且桦褐孔菌破壁水溶液促淋巴细胞增殖作用较4 倍稀释桦褐孔菌破壁水溶液促淋巴细胞增殖作用效果好（P<0.05）。见表3。

表3 鼠脾淋巴细胞增殖指数PI（±s）%

表3 鼠脾淋巴细胞增殖指数PI（±s）%

注：与PBS比较，*P<0.05；与4倍稀释桦褐孔菌破壁水溶液比较，#P<0.05

组别 只 增殖指数PI桦褐孔菌破壁水溶液 8 158.82±2.77*#4倍稀释桦褐孔菌破壁水溶液 8 146.08±6.93 PBS 8 100±0

2.3 细胞因子浓度测定结果 与生理盐水组比较，桦褐孔菌组荷瘤鼠血清TNF-α、IL-2 浓度均偏高（P<0.05），而IL-17、TGF-β 浓度均偏低（P>0.05）。见表4。

表4 各细胞因子浓度测定［pg/ml，（±s）］

表4 各细胞因子浓度测定［pg/ml，（±s）］

注：与生理盐水组比较，*P<0.05

组别 只 TNF-α IL-2 IL-17 TGF-β桦褐孔菌组 8 168.47±11.02* 1.96±0.28* 42.52±3.18 28.44±1.01生理盐水组 8 131.80±5.29 1.35±0.11 47.24±5.40 29.05±1.92

2.4 NK 细胞杀伤活性实验结果 与生理盐水组比较，桦褐孔菌组NK 细胞杀伤活性较高（P<0.05），见表5。

表5 荷瘤鼠NK细胞杀伤活性结果（±s）%

表5 荷瘤鼠NK细胞杀伤活性结果（±s）%

注：与生理盐水组比较，*P<0.05

组别 只 NK细胞杀伤活性桦褐孔菌组 8 17.18±0.17*生理盐水组 8 15.84±0.58

3 讨论

桦褐孔菌，属多孔菌科，生长环境特殊，是一种具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、增强免疫等作用的药用真菌，而具有该药理作用的有效成分主要存在于细胞壁内。细胞壁结构阻碍细胞内有效成分的释放。超声粉碎仪利用超声波在液体中的分散效应，使液体产生空化的作用，从而使液体中的固体颗粒或细胞组织破碎。为更直观的观察桦褐孔菌在超声粉碎仪作用后的有效成分释放情况，通过比较超声粉碎仪不同工作条件下粉碎桦褐孔菌所得水溶液的蛋白浓度，发现在功率为55W，作用时间15min 条件下，超声粉碎仪粉碎桦褐孔菌的效果最好。

在免疫系统相关方面的作用，目前已知具有增强免疫［14-17］、抑菌［18］、抗病毒［19-20］等，但其具体作用机制尚不明确。淋巴细胞是白细胞的一种，是一类具有免疫识别功能的细胞系，在适应性免疫中起关键作用，经血液、淋巴液遍布全身，将淋巴器官和其他器官的淋巴组织连成一个功能整体，使免疫系统具有识别和记忆抗原能力，从而发挥识别和清除侵入机体微生物、异体细胞或大分子物质的作用，并能监护机体内部稳定性，清除表面抗原发生变化的细胞。通过实验发现桦褐孔菌破壁水溶液具有促进鼠淋巴细胞增殖的效应，且该作用与桦褐孔菌水溶液浓度成一定的正相关关系。

细胞因子IL-2 又名T 细胞生长因子，是由活化的CD4+T 细胞和CD8+T 细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子。IL-2 能刺激T 细胞进入细胞分裂周期，能增强T 细胞的杀伤活性，能促进NK 细胞的增殖并增强NK 细胞杀伤活性。（TNF-α）主要由活化的单核/巨噬细胞产生，能促进中性粒细胞吞噬，抗感染，促进髓样白血病细胞向巨噬细胞分化，促进细胞增殖和分化，是重要的炎症因子，并参与某些自身免疫病的病理损伤。本研究发现桦褐孔菌破壁水溶液能升高荷瘤鼠体内IL-2、TNF-α 浓度，且该作用也与淋巴细胞增值、NK 细胞杀伤活性变化相一致。

IL-17 是T 细胞来源的细胞因子，具有促进启动T 细胞介导的炎症反应作用。同时IL-17 可以刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生多种细胞因子，并与其协同作用，提高炎症因子表达水平，招募炎症细胞，放大致炎效应，对肿瘤的发生发展具有促进作用。TGF-β 调节细胞的生长、分化和机体免疫功能，对肿瘤既有抑制作用，也有促进作用。在肿瘤发生早期，TGF-β 能通过抑制肿瘤细胞增殖发挥抗肿瘤作用；而在肿瘤发生晚期，TGF-β 能通过抑制免疫活性细胞的增殖、抑制淋巴细胞的分化、调节细胞表型、抑制细胞因子产生、促进肿瘤内血管生长对肿瘤生长、转移起促进作用。本资料显示，桦褐孔菌组荷瘤鼠血清IL-17、TGF-β 浓度均低于生理盐水组，但差异无统计学意义，故暂不考虑桦褐孔菌破壁水溶液通过调节细胞因子IL-17、TGF-β 浓度实现免疫调节作用。

自然杀伤细胞（NK）是机体重要的固有免疫细胞，具有抗肿瘤、抗病毒及参与免疫调节等作用。NK 细胞来源于骨髓共同淋巴前体细胞，具有部分T 细胞分化抗原。NK 细胞的活性受各种因素影响，如IL-2、IL-12、IFN-α、TNF-α 以及白细胞调节素（LR）对NK细胞的活化和分化有正调节作用，体外培养时加入上述细胞因子可明显提高NK 细胞的杀伤活性，本研究发现桦褐孔菌破壁水溶液能增强NK 细胞活性。

综上所述，桦褐孔菌破壁水溶液通过促进淋巴细胞增殖，提高体内细胞因子IL-2、TNF-α 浓度及增强NK 细胞杀伤活性实现免疫调节作用。