姜黄素通过JAK/STAT3信号通路对大鼠HSC-T6细胞凋亡的影响

武荣荣 李永祥 薛丽丽 张明洋 曹晓轩 沈婷

肝纤维化是肝脏对各种慢性刺激进行损伤修复反应时，胶原在肝内大量沉积，破坏正常肝结构的病理过程［1］。其是一种可逆性病变，逐渐加重可导致失代偿性肝硬化或肝癌［2］。肝纤维化的发生发展受到多种细胞因子及其分子信号通路的调控［3］。因此，通过干预信号通路阻断肝纤维化向肝硬化进展，对肝纤维化的研究和防治具有重要意义。姜黄素是一种从姜黄根茎中提取的多酚类化合物，主链为不饱和脂族及芳香族基团。目前已有多个研究发现，姜黄素通过抗氧化应激、抗炎降脂作用缓解高脂饮食、缺血再灌注等引起的肝损伤［4］。2018 年3 月至2019 年3 月作者通过实验研究，探讨姜黄素对大鼠肝星状细胞抗纤维化的影响。

1 材料与方法

1.1 HSC-T6 细胞培养 大鼠肝星状细胞HSC-T6 细胞株购自武汉普诺赛细胞生物公司。HSC-T6 细胞的培养基为含10%胎牛血清（美国Gibco 公司）、1%青链霉素的1640 培养液（美国Gibco 公司），培养条件为5% CO2、37℃培养箱（美国Thermo Fisher 公司）中。

1.2 姜黄素干预HSC-T6 细胞 选择生长对数期的细胞收集制成单细胞悬液，将密度为1×104/ml 的HSC-T6 细胞接种在96 孔板。实验分为5 组，每组6个副孔，空白组（PBS 缓冲液），对照组（TGF-β），低剂量组（姜黄素10μmol/L），中剂量组（姜黄素50μmol/L），高剂量组（姜黄素100μmol/L）。除空白组外，其余4 组先加入5μmol/L 的TGF-β（美国CST 公司）培养24h，再加入相对药物浓度的新鲜培养液继续培养24h。姜黄素购自美国sigma 公司。

1.3 细胞增殖实验 HSC-T6 细胞药物处理24h 后换无血清培养液，加入10μl/孔的CCK-8 试剂（美国Abnova 公司），继续37℃孵育4h。处理完成后加入DMSO（150μl/孔），终止实验，混匀后室温静置15min，用Multiskan GO 酶标仪（美国Thermo Scientific公司）在540nm 波长处测吸光度值。细胞存活率（%）=药物组OD 值/空白组OD 值。

1.4 细胞凋亡检测 将HSC-T6 细胞用胰酶消化，PBS 缓冲液洗涤后制成单细胞悬液。加入10μl AnnexinV-FITC/PI 凋亡检测抗体（试剂盒购自美国BD公司），孵育15min。PBS 缓冲液洗涤后用BD Calibur 流式细胞仪（美国BD 公司）上机检测。

1.5 荧光定量PCR 检测 采用细胞RNA 提取试剂盒（北京天根生物公司）提取HSC-T6 细胞的总RNA，用NanoDrop 仪（美国Thermo Scientific 公司）检测RNA 浓度和质量。用逆转录试剂盒（日本Takara 公司）将RNA 逆转录为cDNA。用实时荧光定量PCR试剂盒（日本Takara 公司）检测HSC-T6 细胞中JAK和Smad3 的mRNA 表达水平。PCR 仪器为美国ABI 7500 型 号，PCR 反 应 条 件 为95 ℃，10min；95 ℃，15s；60℃，1min，扩增40 个循环，60℃时收集荧光信号。PCR 引物由上海生工生物公司合成。引物序列 是：JAK2 上 游AGCCTATCGGCATGGAATATCT，下 游 TAACACTGCCATCCCAAGACA ；STAT3上 游 CTTTGAGACCGAGGTGTATCACC， 下游 'GGTCAGCATGTTGTACCACAGG ；GAPDH上 游GGATGCAGAAGGAGATCACTG， 下 游CGATCCACACGGAGTACTTG。以GAPDH 作为内参基因，采用2-△△ct计算基因的相对表达量。

1.6 蛋白免疫印迹检测 将药物处理后HSC-T6 细胞用缓冲液洗涤后，加入RIPA 裂解液，冰上裂解20min。离心收集上清蛋白并进行蛋白定量。用12% SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，用PVDF 转膜，脱脂奶粉封闭后加一抗（JAK 稀释1 ∶1000，p-Smad3 稀释1 ∶800，GAPDH 1 ∶1000 稀释，），4℃摇床过夜，TBST 洗膜3 次，二抗（稀释1 ∶1000）孵育1h，显影，采用凝胶图像Image J 软件分析目标条带的灰度值反映相关蛋白的表达水平。抗体均购自美国CST 公司，化学发光成像仪为美国Bio-Rad 公司。以目标蛋白和GAPDH 的灰度值比作为目标蛋白的相对表达量。用Quantity One V 4.6 软件分析结果。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17. 0 统计学软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用ANOVA 单因素方差分析，并进行两两比较。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对活化的大鼠肝星状细胞增殖的影响 为了解不同浓度姜黄素对大鼠HSC-T6 细胞的增殖影响，采用CCK-8 检测细胞存活率。结果发现，经药物处理24h 后，中、高剂量组的HSC-T6 细胞的存活率较对照组明显降低（P<0.05），且随着浓度的增高，存活率下降。而低剂量姜黄素组则无明显改变（P>0.05）。见表1。

表1 不同浓度姜黄素处理组间细胞的存活率（±s）

表1 不同浓度姜黄素处理组间细胞的存活率（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05

组别 细胞存活率（%）低剂量组 78.52±4.74中剂量组 76.35±6.54*高剂量组 72.23±8.31*对照组 84.17±4.12

2.2 姜黄素对活化的大鼠肝星状细胞凋亡的影响 通过流式检测HSC-T6 细胞凋亡情况，PI+为死细胞，Annexin V+为活细胞。研究发现，中、高浓度的姜黄素干预HSC-T6 细胞后凋亡情况比对照组明显（P<0.01），且呈药物依赖性，浓度增加则凋亡更明显。见图1。

图1 经姜黄素干预后HSC-T6细胞的凋亡情况

2.3 姜黄素对大鼠HSC-T6 细胞中JAK 和Stat3 mRNA 表达影响 用荧光定量PCR 检测HSC-T6 细胞中JAK和Stat3 的mRNA 表达量，结果显示：经姜黄素干预后，中、高剂量组均可以降低JAK 和Stat3 的 mRNA 表达下调，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。而未活化的HSC-T6 细胞中JAK 和Stat3 的mRNA 表达量低于对照组。见图2。

图2 经姜黄素干预后JAK和Stat3 mRNA在HSC-T6细胞中表达

2.4 姜黄素可以抑制大鼠HSC-T6 细胞中JAK 和Stat3蛋白表达 经不同浓度姜黄素干预后的HSC-T6 细胞中JAK 和Stat3 蛋白的表达明显低于对照组（P<0.05），且随着姜黄素浓度的增高，JAK 和Stat3 蛋白降低越明显。未活化的HSC-T6 细胞中JAK 和Stat3 蛋白表达量较对照组低。见图3。

图3 经姜黄素干预HSC-T6细胞JAK和Stat3蛋白表达

3 讨论

肝星状细胞是肝脏发生纤维化的过程中的主要效应细胞。活化的肝星状细胞具有较强的增殖能力，可转化为成纤维细胞，产生大量细胞外基质，同时伴有细胞外基质降解减少［5］。而姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗感染及抗肿瘤等作用。本资料结果显示，姜黄素可以明显降低活化的肝星状细胞增殖，细胞凋亡率也显著升高，且具有浓度依赖性。肝星状细胞增殖能力的减弱及数量减少可抑制肝纤维化的发生发展，表明姜黄素对肝纤维化大鼠的肝脏具有明显保护作用。进一步研究发现，姜黄素可以明显下调JAK 和STAT3 的mRNA 以及蛋白的表达。因此，推测姜黄素对肝纤维化大鼠肝脏的保护作用可能是通过降低JAK/STAT3 信号通路来抑制肝星状细胞的增殖以及促进其凋亡，从而具有抗肝纤维化的作用。Janus 激酶/信号转导子与转录激活子（JAK/STAT）通路是细胞信号转导的重要通路之一［6］。JAK2 蛋白可通过激活下游信号STAT3的表达引起一系列的生物学作用，肝脏中存在该通路的许多成员并有表达，JAK/STAT 信号通路的异常表达可导致多种肝损伤。该通路能快速经膜至核传导信号，广泛参与多种细胞的各类病理、生理过程，对机体有重要影响［7-8］。有研究报道［9］，与肝纤维化有紧密联系的炎症因子IL-6 可激活JAK 和STAT3 蛋白，促进肝星状细胞的分化，从而促进肝纤维化的进展。本资料结果证实，抑制JAK/STAT3 信号通路可以促进肝星状细胞的凋亡，降低肝纤维的发生。

姜黄素存在多个作用机制靶点，具有较强的药效学。但具有化学不稳定性、生物学活性较弱、潜在毒性等特点，导致其药代动力学弱，临床应用可能无效，生物利用度低。本结果虽然证实姜黄素可促进活化的肝星状细胞凋亡，下调JAK/STAT3 信号通路，但姜黄素的作用与剂量的相关性，给药途径的影响等问题尚未阐明，因此需要更深入探讨有关姜黄素作用及其相关机制。总之，姜黄素可抑制活化的肝星状细胞增殖，促进其凋亡，其可能是机制是通过下调JAK/STAT3 信号通路，对非酒精性脂肪肝病具有潜在的治疗价值。姜黄素的研究为中医治疗非酒精性脂肪肝病的研究提供新策略。