10种中药单体改善脂毒性研究

郑思彤 钱倩宇 徐甜甜 吴相尧 窦晓兵 柴惠

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是排除过量饮酒或者其他导致肝脂肪变原因、和胰岛素抵抗及遗传密切相关的一种代谢应激性损伤，其重要病理改变是肝细胞脂肪变性和脂质蓄积［1］。NAFLD 普通成人发病率为6.3%~45%，其中10%~30%是非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steato hepatitis，NASH），而包括中国在内的大多数亚洲国家NAFLD 患病率>25%［2］。因脂肪性肝病与糖尿病、肥胖的发生密切相关，有预测［3］，至2030 年或有超过总人口1/3 的人患有脂肪性肝病，其中相当一部分患者进展成脂肪性肝炎。目前防治NAFLD 的药物大多为化学合成，价格昂贵且副作用较多［4］。从化学合成物种筛选新药越来越困难，迫使人们转向天然药物。我国是天然药物资源大国［5］，传统中药药效明确、毒副作用小，是筛选有效的治疗脂肪肝新药的重要研究方向［6-8］。本研究对栀子苷、三七皂苷R1、益母草苷、升麻素、石斛碱、白术内脂I、黄芪甲苷、厚朴酚、鸦胆子素、竹节香附素A，10 种中药单体进行评价，为具有改善脂毒性功能的传统中药的开发及利用提供理论基础。

1 材料和设备

1.1 细胞和试剂 人肝癌细胞（HepG2）购于美国培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）。甘油三酯（triglyceride，TG）检测试剂盒购于北京普利莱基因技术有限公司（批号：E1003）；油 酸（oleic acid，OA）、 棕 榈 酸（palmitic acid，PA）、DMEM、培养基噻唑蓝［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT］、Hoechst33342 荧光染液均购于Sigma 公司（批号：75090、P5585、D5796、11465007001、H21842）；胎牛血清购于Biological industrie 公司（批号：04-00-1ACS）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒购于Thermo 公司（批号：TR20015）；BCA 蛋白浓度检测试剂盒购于碧云天生物技术公司（批号：P0010）；Bodipy493/503 染液购于Invitrogen 公司（批号：D2191）；栀子-栀子苷（Gardenoside，40μM）、三 七- 三 七 皂 苷R1（Notoginsenoside R1，50μM）、益母草-益母草苷（Ajugol，80μM）、防风-升麻素（Cimifugin，40μM）、石斛-石斛碱（Dendrobine，40μM）、 白 术- 白 术 内 脂I（Atractylenolide I，100μM）、黄芪-黄芪甲苷（Astragaloside，100μM）、厚 朴- 厚 朴 酚（Magnolol，20μM）、 鸦 胆 子- 鸦胆子素（Bruceine，50μM）、香附- 竹节香附素A（Anemodeanin A，20μM）均购于成都瑞芬思生物科技有限公司。实验时间2019 年3 月7 月。

1.2 主要仪器和设备 酶标仪为美国MD 公司产品；荧光显微镜购自Leica 公司。

1.3 实验方法 （1）细胞培养：HepG2 细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，在37℃、5% CO2培养箱中进行培养。每天观察细胞生长情况，待细胞融合至密度为80%~90%时进行传代，取对数生长期细胞用于后续实验。（2）细胞干预：①细胞造模：取对数生长期细胞，以105个/ml 的数量接种在24 孔板内，每孔体积1ml，于培养箱中培养24h 后，设未加药物的细胞为对照组，其余组别细胞分别予0.1、0.25、0.5mmol/L 的OA 干预12h，测定肝细胞内TG 含量确定脂质蓄积情况；0.1、0.25、0.5mmol/L 的PA 干预12h，LDH 法检测细胞凋亡情况，选取最佳造模浓度。②药物干预：取对数生长期细胞，以105个/ml 的数量接种于24 孔板内，每孔体积1ml，置于培养箱中培养24h 后，设置空白对照组（UT 组）、模型组及药物干预组，分别为A：栀子苷、B：三七皂苷R1、C：益母草苷、D：升麻素、E：石斛碱、F：白术内脂I、G：黄芪甲苷、H：厚朴酚、I：鸦胆子素、J：竹节香附素A，各组活性单体预处理细胞2h，而后加入OA 或PA 干预12h，检测相关指标。（3）脂质沉积检测：①TG 含量检测：细胞分组及药物处理方案同上，采用TG 检测试剂盒，测定细胞内TG 的含量，并依据蛋白质含量对TG 含量进行校正。通过测定细胞内TG 含量检测细胞内脂质沉积。②Bodipy 染色：脂质染色采用Bodipy法，2μmol/L Bodipy 于37℃染色30min，弃染色液，PBS 洗涤2 次，荧光显微镜下检测。（4）细胞损伤检测：①LDH 法检测细胞凋亡率：各给药组分别收集细胞培养基30μl 加入96 孔板中，再加入LDH 工作液30μl，37℃孵育30min，加入终止液30μl，酶标仪于440nm 处检测吸光度（optical density，OD）值，细胞的损伤程度以各给药组与空白对照组OD 值的比值表示。②MTT 检测细胞存活率：细胞接种于96 孔板中，分组及药物处理方案同上，弃去培养基，向96 孔板中加入MTT 溶液，孵育4h 后弃去上清液，加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）并振荡充分溶解，酶标仪于570nm 处检测OD 值，计算细胞存活率。③Hoechst 染色：2μmol/L Hoechst33342 试剂于37℃染色30min，弃染色液，PBS 洗涤2 次，荧光显微镜下检测。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行分析。计量资料以（±s）表示，先进行方差齐性检验，满足方差齐性时组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂毒性模型建立 分别采用不同浓度的OA 和PA 干预后，与对照组比较，OA 呈剂量依赖关系显著增加肝细胞内TG 含量（P<0.05），见图1A。且通过LDH 释放量检测，发现PA 在HepG2 细胞中也呈剂量依赖性方式表现出明显的细胞凋亡作用（P<0.05），见图1B。随着OA 和PA 的浓度增加，细胞内脂毒性明显上升，因此后续实验中采用0.5mmol/L OA 和0.5mmol/L PA 作为干预因素。

2.2 10 种中药单体的降脂活性 用不同单体预处理细胞后，再予0.5mmol/LOA 干预，结果显示，与UT 组比较，OA 组TG 含量增加明显（P<0.01）；与OA 组比较，三七皂苷、石斛碱、竹节香附素A 组TG 含量下降（P<0.05），栀子苷、升麻素及黄芪甲苷组TG 含量明显减少（P<0.01），差异有统计学意义。见图2A。用Bodipy 染色进行观察显示，与UT 组比较，OA 组绿色荧光强度增加，脂质堆积明显，栀子苷、升麻素及黄芪甲苷组经预处理后，与OA 组相比，绿色荧光强度显著减弱，其余组细胞内荧光强度无明显影响。结果表明，栀子苷、升麻素及黄芪甲苷组可以减轻由OA诱导的脂质堆积。见图2B。

图1 细胞脂毒性模型构建

图2 各组细胞脂质沉积比较

2.3 10 种中药单体的抗凋亡作用 经各中药单体预处理细胞2h，再以0.5mmol/LOA 干预12h，检测培养基中LDH 水平，见图3A。结果表明PA 导致LDH 释放率明显增加，细胞存活率下降（P<0.01），而栀子苷、升麻素及黄芪甲苷组LDH 释放量明显下降，显示其可以减轻PA 诱导的细胞损伤（P<0.01）。见图3B，MTT检测结论与LDH 检测结论一致，PA 导致细胞存活率下降（P<0.01），而栀子苷、升麻素及黄芪甲苷组均能够提高细胞存活率（P<0.01）。其余给药组在抗细胞凋亡方面差异无统计学意义。用Hoechst33342 染色试剂盒进行细胞形态学评估。见图3C。对照组细胞数量较多，细胞间连接紧密，染色后观察可见细胞核大小均一、圆滑，呈弥散均匀的蓝色。PA 组用0.5mmol/LPA单独处理12h 后，出现较多的凋亡细胞，其特征是细胞形态变小，边界收缩，细胞核出现浓染致密块状荧光。栀子苷、升麻素及黄芪甲苷组经预处理后，凋亡细胞数目减少。

图3 各组细胞损伤和细胞存活率比较

3 讨论

NAFLD 是全球最常见的慢性肝病，包括单纯性脂肪肝、NASH、脂肪性肝纤维化和肝硬化。单纯性脂肪肝时进展缓慢，若发展为NASH，则肝内巨噬细胞、星状细胞活化，导致肝内炎症、纤维化的发生发展，最终可进展为肝硬化、原发性肝癌等终末期肝病［9］。至今，NASH 的发病机制仍未清晰。血中游离脂肪酸（freefattyacids，FFAs）浓度升高、肝细胞脂性病变及细胞凋亡增加是NASH 的重要特征。当循环中FFAs 水平升高至超过肝脏的氧化和代谢能力时，会引发脂质在肝脏异位沉积、炎性因子释放和凋亡信号启动，同时肝细胞对炎性反应和各种损伤因素的敏感性也增高，由此导致的肝细胞功能障碍或者死亡称为脂毒性［10］；由此引起的肝细胞凋亡，则称之为脂毒性凋亡。肝细胞脂毒性凋亡在NASH 的发生进展中是十分重要的始动环节且参与整个发病过程。

在细胞常规培养中加入OA 和PA，在体外模拟体内的游离脂肪酸浓度水平。利用TG 法及LDH 法检测脂质蓄积和细胞凋亡情况，确定0.5mmol/L 的OA 及0.5mmol/L 的PA 造模浓度，用于进一步的实验研究。体外脂毒性模型建立后，进行药物活性的筛选，在查阅文献后确定各药物单体给药浓度。经过综合考察细胞内脂质含量的变化，细胞凋亡情况后，筛选出三种能够对细胞内脂毒性产生调节作用的药食同源中药单体，分别为栀子苷（40μM），升麻素（40μM），黄芪甲苷（100μM），均可以降低由OA 诱导的脂质蓄积，对PA 诱导的细胞凋亡具有保护作用。但其具体机制尚不清楚，有待课题组进一步探究。

栀子、防风、黄芪均具有活血通络、祛肝经之瘀等功效，在较多复方制剂中均起活血化瘀、保肝护肝的作用［11-13］。本研究中，栀子苷、升麻素、黄芪甲苷对游离脂肪酸诱导的脂毒性改善作用明显，在细胞水平验证其明确疗效，使其在抗脂毒性功能药物开发方面显示出较大的应用前景，为今后传统中药改善脂毒性功能的开发利用提供一定的理论依据。