双氢青蒿素对急性肺损伤大鼠炎症机制的研究

张杨 王荣丽

急性肺损伤是指各种肺内外因素导致的肺部严重并发症，其病理生理改变为：严重的炎症反应、肺泡-毛细血管屏障损伤、氧化应激、异常活化的凝血等，使肺组织损伤及水肿，导致动脉氧合不足，出现低氧血症。临床上病人表现为进行性的呼吸困难，甚至呼吸窘迫。ALI是导致急性呼吸衰竭甚至多器官功能衰竭的主要原因[1]。多种全身或局部因素可诱发AL,如脓毒症、肺炎、严重创伤等，其中细菌性肺炎是临床上常见的诱因。研究表明细菌性肺炎和继之而来的ALI/ARDS(急性呼吸窘迫综合征)是重症患者发病和死亡的主要原因[2]；近年来，随着细菌分离株中抗生素耐药性的发生率迅速增加。找到新的辅助方法改善的ALI/ARDS愈后，显得尤为重要。

肺泡巨噬细胞是肺部防御机制的第一道防线，被认为可能是 ALI 的启动因子，研究已证明，巨噬细胞在不同微环境刺激下可以发挥抗炎或促炎两种截然不同的作用，其机制是通过干预巨噬细胞的极化：经典活化型巨噬细胞(M1)和替代活化型巨噬细胞(M2)的失衡实现的。其中M1主要发挥炎症作用；而M2主要促进炎症的转归。如2型糖尿病患者体内存在M1/M2的失衡，促炎型M1细胞明显增加, 在糖尿病大血管并发症和糖尿病肾病患者中这种失衡更明显[3]。

青蒿素及其衍生物有抗炎、免疫调节、抗肿瘤的作用[4-6]，双氢青蒿素可调控炎症因子的表达，发挥抗炎作用。但目前尚无研究报道双氢青蒿素影响急性肺损伤中巨噬细胞的极化。本实验将通过大肠杆菌诱导大鼠急性肺损伤模型，来探讨双氢青蒿素抗炎及对ALI时巨噬细胞极化的影响。

材 料

一、菌株

大肠杆菌ATCC25922由西南医科大学医学检验科提供；实验前使用麦氏比浊法将细菌浓度调整为3×108cfu/mL备用。

二、试剂

TNF-α、VEGF、IL-10 Elisa试剂盒(96t 酶联生物)；Trizol(天根公司)，双氢青蒿素(纯度≥98% 805D021)、RPMI1640培养基(北京索莱宝公司)；逆转录试剂盒(TAKARA公司)；SYBR Green PCR 试剂盒(KAPA Biosystem公司)。

三、仪器

干燥箱(上海博迅实业有限公司)；-80°冰箱(日本sanyo公司)，37℃恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；550型酶标仪(北京普朗新技术有限公司)；台式离心机(上海安亭科学仪器厂生产 )；荧光定量PCR扩增仪(CFX-Connect96 美国伯乐公司)。

四、实验动物

SD大鼠由成都达硕实验动物有限公司提供(批号：scxk(川)2015-030)，体重180～220g。饲养在西南医科大学实验动物中心，饲养环境：室温22～25℃，室内空气湿度50%～60%，白天和黑夜各12 h，独自摄食、饮水。

方法和结果

一、模型制备及取材参考文献

40只雄性SD大鼠编号1～40，由SPSS软件生成随机数列分为五组大肠杆菌组(E-coli)、对照组(Control)、双氢青蒿素低剂量组(low 5 mg·kg-1)、双氢青蒿素中剂量组(Medium 15 mg·kg-1)、双氢青蒿素高剂量组(High 25 mg·kg-1)。每组8只；大鼠适应性喂养6 d后，双氢青蒿素采用植物油溶解，双氢青蒿素低、中、高剂量组分别予以对于剂量双氢青蒿素连续灌胃3 d，1天2次[7-9],大肠杆菌组和对照组予以同等剂量生理盐水灌胃；最后一次灌胃处理后1 h，腹腔水合氯醛麻醉大鼠，直视下大肠杆菌组、双氢青蒿素低、中、高剂量组分别于气管内滴入大肠杆菌0.5mL (3×108)造模[10-11]。造模后24 h，水合氯醛麻醉大鼠,腹主动脉取血，常温下静置30min，4℃，3000 r·min-1离心10 min，取血清-80℃保存；开胸取右肺中叶、右下肺叶，分别行苏木精-伊红(HE)染色、肺湿干质量比；结扎断端，暴露、游离气管，行肺泡灌洗：22G留置针插入主支气管，抬高大鼠头部，3mLPBS分三次灌入，回收率约60%；灌洗液放置无酶EP管内，4℃2500rmp离心10 min收集上清于-80°冰箱保存；细胞沉渣用RMP1640重悬、洗涤细胞，离心，去上清，加入1mL Trizol,-80℃保存。

二、肺组织病理评分

右肺中叶取出后立即放入4%甲醛溶液固定，常规脱水、包埋切片，HE染色，光镜下观察病理损伤情况。肺脏组织病理评分参照smith评分系统[12]。对肺水肿、肺泡及间质炎症、肺泡及间质出血、肺实变形成，分别进行0～4分的半定量分析：无损伤0分，病变范围<25%为 1 分，病变范围占 25%～50%为2分，50%～75%为3分，病变满视野为4 分，肺损伤评分为上述各项之和。

三、肺湿干质量比(W/D)

取出大鼠右肺下叶，称湿质量后置于烤箱(60℃24 h)烤到恒定质量，称干质量，W/D计算公式：湿重/湿重-干重。

四、ELisa法测肺泡灌洗液及血清中TNF-α、VEGF、IL-10

将-80℃存储的肺泡灌洗液、血清，按照试剂盒操作方法测肺泡灌洗液及血清中TNF-α、VEGF、IL-10的浓度。

五、RT-PCR 法检测大鼠肺泡灌洗巨噬细胞Arg-1、iNOS、IL-1ra、IL-1β的mRNA表达

从-80℃冰箱中取出含trizol的大鼠肺泡巨噬细胞，按逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板用SYBR Green PCR试剂盒进行荧光定量PCR扩增。通过分析仪器读取CT值，用2-ΔΔCT分析基因的相对表达量，以β-actin 为内参。引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成(见表1)。

表1 Arg1、iNOS、IL-1ra、IL-1β引物序列

六、统计学分析

七、结果

1 各组大鼠肺组织HE染色及病理评分

Contol组肺泡结构完整，未见明显病理改变；E-coli组可见肺泡结构破坏；肺间隔明显增宽，肺间质水肿、出血，肺内大量炎症细胞的浸润；双氢青蒿素Low组可见肺泡结构破坏，肺间隔明显增宽，间质水肿，肺内炎症细胞浸润；Medium组肺泡结构破坏，可见间隔增宽，水肿及炎症细胞浸润程度减轻；High组肺泡结构破坏，间隔增宽，水肿及炎症细胞浸润明显减轻。

图1 各组大鼠肺组织HE染色(×10)

A：E-coli组； B：Control组；C：Low组(5 mg·kg-1)；D：Medium组( 15 mg·kg-1)；E ：High组(25 mg·kg-1)

2 各组大鼠肺组织病理评分 Simth评分评估大鼠肺组织病理损伤：其中与Control组比较，E-coli组的肺组织评分明显升高(P<0.05)；DHA灌胃治疗，与E-coli组比较，Low、Medium、High组肺组织Smith评分降低，其中Medium、High组smith评分明显降低(P<0.05)；提示双氢青蒿素可减轻大肠杆菌造成的肺组织损伤(见表2)。

表2 各组大鼠肺组织Smith评分

vsE-coli#P<0.05，vscontrol*P<0.05

3 肺组织湿干质量(W/D)比 肺W/D比主要反应肺组织水肿情况，其中E-coli组肺组织W/D比较Control组明显升高(P<0.05)，双氢青蒿素Low、Medium、High组治疗可减轻ALI 大鼠的 W/D 比，其中Medium、High组smith评分比E-coli明显降低(P<0.05)(见表3)。

表3 各组大鼠肺组织W/D

vsE-coli；#P<0.05，vscontrol*P<0.05

4 血清及支气管肺泡灌洗液TNF-α、VEGF、IL-10浓度 Elisa试剂盒检测各组血清、BALF中细胞因子：其中与Control组比较，E-coli组灌洗液、血清中TNF-α、VEGF浓度明显升高(P<0.05)，灌洗液、血清中IL-10浓度明显降低(P<0.05)；DHA治疗后，与E-coli组比较，Low、Medium、High组大鼠灌洗液中TNF-α、VEGF浓度明显降低(P<0.05)；IL-10的浓度明显升高(P<0.05)(见表4、5)

表4 各组大鼠支气管肺泡灌洗液中TNF-α、VEGF、IL-10的浓度

vsE-coli#P<0.05vscontrol*P<0.05

表5 各组大鼠血清中TNF-α、VEGF、IL-10的浓度浓度

vsE-coli#P<0.05vscontrol*P<0.05

5 大鼠支气管肺泡灌洗液巨噬细胞Arg1、iNOS 、IL-1ra、IL-1βmRNA表达情况 PCR检测支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞表型：其中与Control组比较，E-coli组大鼠巨噬细胞Arg1、IL-1ra mRNA表达减弱，iNOS 、IL-1β mRNA表达增强(P<0.05)，巨噬细胞表型以M1为主；与E-coli组比较，Medium、High组DHA灌胃后Arg1、IL-1ra mRNA表达增强，Low组仅Arg1表达增强，而Low、Medium、High iNOS、IL-1β mRNA表达均减弱(P<0.05)，巨噬细胞表型以M2为主(见图2、3)。

图2 各组大鼠支气管肺泡巨噬细胞iNOS、Arg-1amRNA表达情况

vsE-coli#P<0.05vscontrol*P<0.05

图3 各组大鼠支气管肺泡巨噬细胞IL-1β、IL-1ramRNA表达情况

vsE-coli#P<0.05vscontrol*P<0.05

讨 论

ALI/ARDS是一类严重的肺部并发症，其病情危重，死亡率高，造成沉重的经济负担。诱导ALI的方式有很多，LPS是诱导ALI/ARDS最常见的方法，但内毒素并不完全等同于细菌所致的ALI，采用大肠杆菌能更好的模拟细菌性肺炎所致ALI的生理病理过程，更符合临床实际，同时大肠杆菌也常常作为诱导实验性ALI的替代物[13-14]。本实验采用直视下气管内滴入大肠杆菌方法成功诱导急性肺损伤模型，大鼠表现出精神萎靡、打喷嚏、呼吸急促。光镜下病理切片可见肺泡结构破环、肺间质增宽、间质水肿、大量炎症细胞浸润。Smith评分几乎能涵盖ALI肺脏病理损伤的全部表现，可半定量评估肺的炎症程度[15].模型大鼠病理切片显示Smith评分明显升高。肺水肿是ALI重要病理改变。评估肺水肿最简单且最重要的的方法是W/D比。而VEGF是另一种有效评估肺水肿的炎症因子。因为VEGF能够对肺泡毛细血管膜的上皮和内皮均产生影响，其对血管通透性的诱导作用是组胺的20000倍[16]。在将VEGF156腺病毒输送至大鼠肺内的研究中，大鼠呈现出非心源性肺水肿、肺组织毛细血管通透性增加、肺W/D比增加[17]，表明VEGF参与ALI肺水肿过程。本实验同时采用W/D比及VEGF浓度评估肺水肿，发现大肠杆菌诱导大鼠肺组织W/D比及VEGF都呈不同程度的升高，其升高趋势是一致的。

青蒿素作为传统中药，除了抗疟疾作用外，还具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤等特点[4,17-18]。青蒿素可以减少炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、黏附因子的表达，抑制中性粒细胞的浸润等，发挥抗炎作用[5-6]。双氢青蒿素(DHA)作为青蒿素衍生物中的一种，它不仅具备青蒿素的所有药理特点，同时它的副作用更小，药效更高。随着双氢青蒿素研究的深入，发现双氢青蒿素可抑制NF-κB通路而抗炎[19]；在博来霉素诱导的肺纤维化模型中，双氢青蒿素可以抑制纤维增生[6]；在LPS诱导的小胶质细胞炎症中，双氢青蒿素可以抑制iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA的表达[20]。本实验中，双氢青蒿素减轻大肠杆菌所致急性肺损伤的smith评分，呈剂量依赖性。DHA同样减轻大肠杆菌所致急性肺损伤的W/D。目前研究针对DHA对VEGF的作用机制主要是抗肿瘤：DHA通过抑制VEGF的表达及肿瘤血管的形成诱导肿瘤细胞的凋亡[17-18]；针对DHA对ALI中炎症所致VEGF的调节，尚未有报道。本实验对各组大鼠肺组织及血清中VEGF进行检测，发现DHA同样减轻急性肺损伤大鼠体内的VEFG浓度，说明，DHA可以降低大肠杆菌诱导的急性肺损伤中VEGF。DHA通过减轻W/D比及VEGF来减轻肺水肿。但具体的机制还需要进一步研究。

炎症细胞在ALI的发生发展中起着非常重要的作用，既往认为中性粒细胞是ALI中最重要的细胞。但随着研究进展，发现巨噬细胞的在ALI的发生发展亦中起着举足轻重的作用。肺巨噬细胞被认为是肺部防御的第一道防线，是ALI的启动因素。肺巨噬细胞并非为单一的活化形式，据其所处微环境及其中细胞因子、生长因子，TLRs，信号通路(NF-κB、STATs、AP-1等)等不同，巨噬细胞可以极化为不同的表型[21]：经典活化型：M1和替代活化型：M2。M1/M2动态变化，反映机体免疫状态，其极化方向在疾病的抗感染免疫和抗炎症反应的病理生理过程中发挥重要作用，甚至直接影响疾病的结果。其中M1作用的延长或放大，M2防御的缺陷被认为是ALI发生发展的关键所在[21]。内毒素和INF-γ可使巨噬细胞极化为M1，在本实验中大肠杆菌细胞壁上的脂多糖就起着极化M1的作用；M1主要表面标记物有：iNOS、IL-6、MHC-II。活化的M1吞噬病原体、凋亡细胞，释放促炎因子TNFα、(IL)-1β、IL-6、 IL-12、 IL-15、 IL-23, 产生ROS、RNS、蛋白水解酶及生物活性脂，参与机体的炎症应答[21]。在博来霉素、油酸、内毒素、二氧化硅诱导的急性肺损伤中，抗炎类固醇阻断M1的促炎活性，可以减轻肺组织损伤[22-23]，可见过分活化的M1会导致肺组织损伤，发生ALI。但M1的生物活性作用可以被M2平衡。IL-4、IL-13可使肺巨噬细胞极化为M2。其主要表面标记物有：FIZZ1、 Arg1。M2主要发挥抗炎、组织修复及免疫调节作用, 通过增强抗炎因子IL-10、IL-1ra、IL-13及VEGF、EGF、PDGF表达，促进组织修复、重塑、血管生成，并保持稳态[21,24]。研究发现M2型巨噬细胞通过分泌抗炎因子IL-4、IL-10等在病毒性心肌炎、急性肾炎等的发病过程中起到了保护作用[25]；而暴露于吸烟、博来霉素、内毒素下的动物，肺组织中M2细胞数量增加，它们上调炎症因子IL-4、IL-10、IL-13的表达，这些因子介导和刺激细胞外基质、生长因子的产生，促进组织的修复[22,26-27]。提示肺损伤的转归则很大程度上是由M2介导的。不过在急性肺损伤的早期，肺组织中巨噬细胞以M1为主[21]，细胞形态学改变及诱导iNOS及TNF-α的表达可以佐证。M2总是迟于M1的出现，如果可早期刺激M2的表达，逆转M1/M2失衡，则可以减轻M1的作用，避免疾病的加重。结合上述双氢青蒿素可以抑制炎症通路，下调炎症因子TNF-α、IL-1β等的表达，猜测双氢青蒿素可能改变巨噬细胞所处微环境，从而影响巨噬细胞的极化。为此，本实验将iNOS作为M1的表面标志物，IL-1β为M1的炎症因子，血清及灌洗液TNF-α作为促炎因子；Arg1作为M2的表面标志物，IL-1ra为M2的炎症因子，血清及灌洗液中IL-10作为抑炎因子。发现与Control组比较，E-coli组大鼠巨噬细胞表型以iNOS为主，IL-1β水平明显升高，血清及灌洗液中炎症因子以TNF-α为主；即ALI中巨噬细胞表型以M1为主。与E-coli组，双氢青蒿素治疗后，大鼠肺泡巨噬细胞表型以Arg1为主，IL-1ra水平明显升高，血清及灌洗液中炎症因子以IL-10为主。双氢青蒿素治疗改变了巨噬细胞的表型，使巨噬细胞表型向着促进疾病转归的方向发展。这可能与DHA的抗炎机制改变了ALI大鼠体内的炎症水平及微环境有关。但双氢青蒿素具体通过那种信号通路改变了巨噬细胞的极化，还需要进一步的研究来证明。

综上，本实验结果表明:1)、双氢青蒿素灌胃治疗可以减轻急性肺损伤炎症；2)、双氢青蒿素影响肺泡巨噬细胞的极化；双氢青蒿素可能成为治疗急性肺损伤的一种新方法。