白酒酒糟中高耐性酵母菌的分离筛选和改良研究

张 彬，高一切，刘东敏，韩芸娇，张媛媛

（1.石家庄学院 a.人事处；b.化工学院,河北 石家庄 050035;2.承德市科学技术情报研究所,河北 承德 06700）

0 引言

燃料乙醇作为可再生清洁能源，格外受到科学工作者的青睐.随着国家各项环保政策的出台以及新能源产业的兴起，使得生物乙醇这类新型可再生能源再次成为研究的热点[1，2].一直以来，乙醇生产菌大多采用酿酒酵母，其特有的生理特性和发酵性能可以产生人类需要的乙醇[3].乙醇发酵过程中酿酒酵母会受到诸多因素影响，包括温度、渗透压以及产物抑制作用，其中产物的抑制作用对乙醇的生产能力制约最为强烈.因此，通过提高生产菌株的耐受性可以进一步提高乙醇的产量，从而提高乙醇的产率，降低企业的生产成本.

本研究采用的是自然分离筛选和紫外诱变育种相结合的方法[4]，从白酒酒糟中分离筛选出长势优良的纯种酵母，对其进行紫外诱变，通过耐受性实验，筛选出具有高耐受性的乙醇生产菌株，从而达到提高乙醇产率、减少能耗和降低成本的目的.

1 实验材料与仪器

1.1 材料与试剂

酒糟由五粮液酒厂提供；新啤酵母（实验室保藏），丹啤酵母（实验室保藏）；无水葡萄糖（北京奥博星生物技术有限公司）；酵母膏（北京奥博星生物技术有限公司）；琼脂（北京奥博星生物技术有限公司）；青霉素（河北医科大学第一医院）；三苯基四氮唑盐酸盐（TTC）（成都百事兴科技实业有限公司）；蛋白胨（北京奥博星生物技术有限公司）.

1.2 培养基

富集培养基及种子培养液：酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂（YPD）液体培养基（20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，1%酵母膏）；平板分离及斜面保藏用培养基：YPD固体培养基（20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，20 g/L琼脂，10 g/L酵母膏）；初筛：TTC上层培养基（TTC 0.05 g，葡萄糖0.5 g，琼脂 0.5 g，100 mL无菌水）；TTC 下层培养基：YPD固体培养基；发酵培养基（YFM）（150 g/L的葡萄糖，5 g/L的酵母膏）.

1.3 仪器与设备

恒温培养箱（DHP-9052，天津顺诺股份有限公司）；摇床（MX-YZ，金坛市梅香仪器有限公司）；超净台（SW-CJ-1Cu，郑州宏朗有限公司）；紫外分光光度计（UV-6100BS，上海美普达股份有限公司）；紫外诱变仪（CBIO-OV4，北京赛百奥科技有限公司）；高温灭菌锅（LX-B100L，合肥华泰有限公司）；乙醇计（武强县华鸥仪器仪表厂）.

2 实验方法

2.1 酵母的分离筛选

2.1.1 取样

准确称取10 g酒糟，加入150 mL无菌水，共10组，120 r/min下悬摇10 min，纱布过滤后用于富集培养[5].

2.1.2 富集培养

移取菌液5 mL加入装有150 mL富集培养基的三角瓶中，添加适量青霉素，于30℃、120 r/min下进行传代培养，每48 h接种一次，重复3次后进行分离纯化.

分别取一环新啤酵母和丹啤酵母接入到盛有150 mL富集培养基中重复上述操作.

2.1.3 分离纯化

移取1 mL富集好的菌液，在装有10 mL无菌水的试管中稀释7次，然后吸取0.1 mL稀释好的菌液涂布于分离培养基平板上，30℃下恒温培养24 h，挑取具有典型酵母菌落特征的菌落至YPD斜面培养，培养结束后进行划线分纯并保藏.

2.1.4 初筛

分别取分离得到的菌株各一环依次接入到TTC下层培养基中，30℃下恒温培养24 h，长出菌落后将上层培养基倒在下层培养基上，30℃恒温、阴暗放置2～3 h.产乙醇能力较强酵母菌具有可还原TTC的特性，使其变为深红色，根据这一特性筛选出长势良好的菌落，接种于斜面培养基中低温保存.

2.1.5 复筛

分别接一环斜面培养基中的菌种于种子培养液中，于30℃、170 r/min条件下的生物摇床中培养24 h.取4 mL菌悬液接入装有80 mL发酵培养基的锥角瓶中，于30℃下的恒温培养箱中静置发酵24 h，计算其产气情况及乙醇含量.

2.1.6 紫外诱变

取复筛后的酵母菌接种于种子培养液中培养12 h，45℃下处理20 min，然后取5 mL菌液于无菌平板中进行紫外垂直照射（紫外灯功率15 W，照射距离20 cm，照射时间30 min），然后对菌液进行富培、分离、纯化，并对菌体进行镜检.

2.2 酵母的耐受性实验

2.2.1 耐受性实验

2.2.1.1 耐热性实验

取一环菌种于发酵培养基中分别在30，35，40，45℃条件下进行发酵培养48 h，观察菌种生长情况.

2.2.1.2 耐乙醇浓度实验

分别设置种子培养液的乙醇起始浓度为0%，4%，6%，8%，12%，16%，于30℃下恒温培养24 h，观察菌种生长情况，使用紫外分光光度计测定菌液吸光值.

2.2.1.3 耐糖度实验

分别设置发酵培养基糖起始浓度为150，250，350，450 g/L，30℃下培养48 h，用密度瓶法测定菌液生长情况.

2.2.2 乙醇浓度测定

采用密度瓶法计算发酵液中乙醇的含量.用干净恒重后的100 mL容量瓶准确称取发酵液100 mL，倒入蒸馏瓶中，用50 mL蒸馏水分多次润洗容量瓶，冲洗液也全部倒入蒸馏瓶中.连接冷凝装置，使用恒温水浴锅控制温度为80℃，室内温度不高于25℃，开启冷凝水，对发酵液进行缓慢加热蒸馏.蒸馏操作完成后将收集的馏出液倒入100 mL容量瓶中，调节瓶内的液温至20℃，用蒸馏水定容至100 mL，备用.反复对密度瓶进行清洗、干燥、称量等操作，至其恒重.将煮沸并冷却的蒸馏水注满处理好的密度瓶，插上温度计，浸于20℃恒温水浴锅中恒温处理，瓶中液温达到20℃，并保持5 min以上不变时，取出密度瓶，用滤纸吸取支管中溢出的水，盖好小帽，用擦镜纸擦拭干净后放入分析天平进行称量.将水倒净，用备好的馏出液样品润洗密度瓶2～3次，注满密度瓶，重复以上操作步骤.20℃发酵液馏出液的密度ρ液利用式（1）计算：

式中ρ液表示发酵液馏出液在20℃时的密度，g/L；m表示密度瓶质量，g；m1表示20℃密度瓶于注满密度瓶蒸馏水的总质量，g；m2表示20℃密度瓶于注满密度瓶发酵液馏出液的总质量，g.最终发酵液的乙醇浓度可通过对照表（20℃）查得.

3 结果与分析

酒糟中分离的菌株经初筛和复筛得到两株生产乙醇能力较强的酵母菌，编号分别为223和261，通过紫外诱变选育得到菌株Z223和Z261，以丹啤酵母和新啤酵母作为对照样，进行后续实验.

3.1 几种酵母菌耐热性实验结果

3.1.1 酵母对高温的生长耐受性结果

对筛选菌株、诱变菌株和对照菌株进行耐热性实验，测试其在30～50℃范围内的生长情况，结果如表1所示，从表1可以看出，在30℃下，诱变菌株Z223和Z261、原始菌株223和261以及对照菌株丹啤、新啤均生长良好，超过40℃对这几种酵母菌的生长都有一定的影响，在50℃下，都没有生长现象，总的来说，这几种酵母菌的耐热性能没有明显差异.

表1 温度对菌落生长的影响

表2 不同温度下酵母菌的吸光值变化

3.1.2 酵母菌在不同温度下的生长情况

将6种酵母菌置于不同温度下进行液体培养，并于560 nm测定吸光度值，结果如表2所示，从表2可以看出，诱变菌株Z223和Z261的活力较高，在各温度下进行培养其吸光值明显高于其他4株酵母菌，说明这两株酵母菌活力较强，在相同的条件下生长得到的菌液浓度较高.

3.1.3酵母菌在不同温度下乙醇生产能力比较

对6种酵母菌在不同温度下的乙醇生产能力（乙醇浓度）进行测定，所得结果见表3，从表3可以看出，菌株Z223、Z261、223和261与对照组相比都具有较好的乙醇生产能力，在高温下诱变得到的菌株Z223、Z261表现出更好的乙醇生产能力.

综上所述，和对照组相比，菌株Z223、Z261、223和261在高温下具有更好的生长能力和乙醇生产能力，在这4株酵母菌中诱变菌株Z223的高温耐受性和生产性能更好.

3.2 几种酵母菌乙醇耐受性实验结果

3.2.1 酵母菌对乙醇的生长耐受情况

将6种酵母菌分别接种入不同乙醇浓度的培养基中进行培养，对其生长情况进行记录，结果如表4所示，从表4可以看出，相比于对照组，菌株Z223、Z261、223和261具有更好的乙醇耐受性.尤其是菌株223和Z223在12%乙醇浓度的培养基中仍然能够生长繁殖.

3.2.2 酵母菌在不同乙醇浓度下的生长情况

将6种酵母菌在含不同乙醇浓度的液体培养基中进行培养，之后测定吸光度值，结果如表5所示，由表5可知，随着培养基乙醇浓度的增加，酵母菌生长受抑制的现象明显，说明高浓度乙醇对酵母的生长繁殖有一定的抑制作用.菌株223和诱变菌株Z223在高浓度乙醇存在的情况下，仍然具有较好的生长繁殖能力，尤其是菌株Z223，相较于对照组，其乙醇耐受力良好.

表3 发酵温度对酵母菌生产乙醇能力的影响%

表4 乙醇浓度对菌落生长的影响

3.3 几种酵母菌糖耐受性实验结果

3.3.1 酵母菌对糖浓度的生长耐受情况

蔗糖在酵母发酵过程中会转化为乙醇和二氧化碳，在适宜糖浓度的范围内，糖浓度越高，乙醇浓度也就相对增加，但是如果糖浓度过高，就会改变酵母细胞渗透压，抑制菌株生长[6].将6种酵母菌分别培养在不同糖浓度的培养基中，观察其生长情况，结果见表6，通过表6可以看出，发酵起始糖浓度在150 g/L和250 g/L的时候所有菌株长势均良好，当起始糖浓度达到350 g/L时，菌株生长势头逐渐趋缓，在450 g/L的条件下，菌株223、261和对照菌株已经停止生长繁殖，而菌株Z223和Z261在高浓糖溶液中长势较好.

3.3.2 酵母菌在不同糖浓度下乙醇生产能力比较

对6种酵母菌在不同起始糖浓度下的发酵性能进行测定，结果如表7所示，从表7可以看出，当培养液中糖浓度为250 g/L，各酵母菌的乙醇生产能力都达到高峰，再增加糖浓度，乙醇生产能力反而会下降.菌株Z233和Z261在高糖浓度下的乙醇生产性能要优于其他4种酵母菌.说明经诱变得到的酵母菌对乙醇的耐受性较好.

表5 不同乙醇浓度下酵母菌的吸光值变化

表6 糖浓度对菌落生长的影响

表7 糖浓度对酵母菌生产乙醇能力的影响%

4 结论

通过自然分离筛选法从白酒酒糟中分离筛选出长势优良的两株酵母菌223和261，分别经过紫外诱变，得到诱变菌株Z223和Z261.通过实验发现，诱变菌株Z223和Z261具有较好的高温耐受性和高糖耐受性，菌株Z233具有较为突出的乙醇耐受性，可以在12%乙醇浓度下进行生长繁殖，具有很好的应用前景，可作为工作化生产菌株使用.