黄芩素与黄芩苷联合用药对口腔鳞癌细胞增殖、迁移的影响

郭净洁，王 崇，张维甲，杜 超，李国林

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)简称口腔鳞癌，是最常见的口腔癌[1]。其复发率约为10%～30%,五年存活率为50%,淋巴结转移和局部侵袭是其预后不佳的主要原因[2-3]。因此如何有效地抑制癌细胞转移是控制其复发、提高生存率的关键因素。

黄芩素(baicalein)和黄芩苷(baicalin)是从中药黄芩的干燥根中提取的黄酮类单体，具有抗炎、抗氧化、保护心脑血管等作用[4]。黄芩中含量最高的黄酮类化合物为黄芩素，其与一分子葡萄糖醛酸结合可形成黄芩苷[5]。研究发现，黄芩素进入动物体内后，在血液中迅速转换为黄芩苷及其他产物；黄芩苷口服后，需在肠道内酶解为黄芩素方能吸收入血，进而转化为黄芩苷[6]。近些年来,黄芩素和黄芩苷因有着较好的抗肿瘤效果，受到越来越多的关注[7]。王根桃等[8]发现黄芩素可以通过ERK-FAK信号通路来达到抑制口腔鳞癌的增殖能力。钟文德等[9]证实黄芩苷可有效抑制人舌鳞癌细胞的迁移能力。有研究发现黄芩素与黄芩苷联合应用对肝癌细胞有明显的抑制作用[10]。而两药联合作用于口腔鳞癌的研究在国内外尚未见报道。此外,有文献称EMT在肿瘤的转移中起到重要作用[11]。因此本课题旨在探讨黄芩素与黄芩苷联合应用对口腔鳞癌细胞增殖、迁移能力的影响，以及是否通过影响EMT进程来实现对口腔鳞癌的抑制作用。以期为口腔肿瘤的治疗提供一种新的方法与思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

CAL-27口腔鳞癌细胞株为哈尔滨医科大学转化中心实验室细胞库保存；黄芩素、黄芩苷(上海源叶生物科技有限公司，纯度>98%)，DMEM、胰蛋白酶(Hyclone公司，美国)；双抗(GIBCO公司，美国)；胎牛血清(Biowest公司，美国)；二甲基亚砜(DMSO，国产分析纯，上海国药集团)；四甲基偶氮唑盐 (MTT，Sigma公司，美国)；E-钙粘抗体(E-cadherin，Abcam公司，美国)；N-钙粘抗体(N-cadherin，Abcam公司，美国)；酶标仪购自美国Biotek公司；超净工作台购自上海博迅实业有限公司；倒置相差显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 主要试剂的配制

黄芩素溶液：准确称取20 mg黄芩素粉末，溶于100 μL DMSO中，配制成 200 g/L的母液，0.22 μL孔径滤器过滤，-20 ℃保存。

黄芩苷溶液：准确称取20 mg黄芩苷粉末，溶于100 μL DMSO中，配制成200 g/L的母液，0.22 μL孔径滤器过滤，-20 ℃保存。

1.3 细胞培养

CAL-27细胞解冻后用含10%胎牛血清(FBS)和1%的双抗的DMEM培养基，于37 ℃，含5%CO2的恒温培养箱培养，待细胞密度达到80%以上时，进行实验。

1.4 方法

1.4.1 MTT实验 CAL-27细胞(密度为8×103个/孔)接种于96孔板，孵育12 h待细胞贴壁后，弃去培养液，分别加入200 μL不同浓度的黄芩素(50、100、150、200、300、400 mg/L)、黄芩苷(50、100、150、200、300、400 mg/L)及两药混合(黄芩素170.5 mg/L，黄芩苷190.3 mg/L)培养液，每组六个复孔，对照组不加药。培养48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，避光4 h。弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，慢速震荡10 min。应用酶标仪测定490 nm处的吸光度值(OD值)。

1.4.2 划痕实验 CAL-27细胞(密度为5×105个/孔)接种于6孔板中。孵育待贴壁细胞铺满六孔板底90%以上，用10 μL枪头垂直孔板底部划痕。PBS冲洗3遍，洗去脱落细胞，分别加入2 mL黄芩素(170.5 mg/L)、黄芩苷(190.3 mg/L)及两药混合(黄芩素170.5 mg/L，黄芩苷190.3 mg/L)的培养液，每组3个复孔。对照组不加药，于0、6、12、24 h在倒置显微镜下拍照，观察细胞愈合情况并计算细胞迁移率，公式如下：细胞迁移率(愈合率)=(T0时划痕面积-Tt时划痕面积)/T0时划痕面积×100%。

1.4.3 免疫荧光实验 CAL-27细胞(密度为4×104个/孔)接种于24孔板中，孵育12 h后，分别加入1 mL黄芩素(170.5 mg/L)、黄芩苷(190.3 mg/L)及两药混合(黄芩素170.5 mg/L，黄芩苷190.3 mg/L)的培养液，对照组不加药，48 h后，Hoechst进行细胞核染色30 min，多聚甲醛溶液固定15 min，将固定的细胞与5%的BSA溶液避光封闭30 min，分别加入E-cadherin和N-cadherin抗体，4 ℃孵育过夜后加入荧光二抗，室温避光孵育30 min，于荧光显微镜下观察并记录。

1.4.4 联合指数(CI) 为了确定黄芩苷与黄芩素两者联合应用是单纯两者药效叠加作用还是协同作用，我们在本实验中引入了Chou-Talady的中效原理计算CI，其计算公式为：

D1和D2是药物1和药物2联合作用抑制率为50%时的药物浓度，Dx1和Dx2是药物1和药物2分别单独应用时，抑制率为50%时的药物浓度。根据Chou-Talady理论，如果CI=1，药物联合作用效果为叠加；CI<1，药物联合作用效果为协同；CI>1，药物联合作用效果为拮抗[12]。

1.5 统计学分析

实验结果采用SPSS 19.0、 compusyn进行分析，数据表示为均值±标准差。两组间分析采用t检验，多组间分析应用单因素方差分析，P<0.05视为有统计学意义，CI<1视为两药有协同作用。

2 结 果

2.1 黄芩素、黄芩苷及两药联合时对CAL-27细胞增殖的影响

MTT实验证明不同浓度的黄芩素、黄芩苷可以抑制CAL-27细胞的增殖，随着药物浓度的增加，抑制作用逐渐增强(图1a、1b)。计算得出，48 h时，黄芩素与黄芩苷的IC50值分别为170.5 mg/L和190.3 mg/L。选取空白对照组，黄芩素(170.5 mg/L)、黄芩苷(190.3 mg/L)和两药混合(黄芩素170.5 mg/L，黄芩苷190.3 mg/L)作用CAL-27细胞48 h，各组存活率分别为(46.96±6.89)%、(49.17±4.40)%、(31.87±4.98)%(图1c)。联合用药与黄芩素、黄芩苷相比对CAL-27细胞增殖的抑制作用更强。差异具有统计学意义(P=0.045，P=0.000 3，CI=0.552 31)。

*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；a：黄芩素对CAL-27细胞活力的影响；b:黄芩苷对CAL-27细胞活力的影响；c:黄芩素、黄芩苷及联合用药对CAL-27细胞活力的影响

图1不同用药对细胞活力的影响

Fig.1Effects of different drugs on cell viability

2.2 黄芩素、黄芩苷及联合用药对CAL-27细胞的迁移能力的影响

划痕实验表明，6 h时，对照组愈合率为(23.8±1.6)%，黄芩素组愈合率为(10.9±2.9)%，黄芩苷组愈合率为(16.4±1.9)%，联合应用组愈合率为(1.3±2.0)%，黄芩素、黄芩苷、联合用药组均低于对照组(P=0.038，P=0.044，P=0.008)，且联合用药组低于黄芩素、黄芩苷单药组(P=0.006,P=0.004)。12 h时，对照组愈合率为(42.7±1.7)%，黄芩素组愈合率为(19.4±1.6)%，黄芩苷组愈合率为(24.5±1.0)%，联合应用组愈合率为(15±1.9)%，黄芩素、黄芩苷、联合用药组均低于对照组(P=0.002,P=0.003,P=0.002)，且联合用药组低于黄芩素、黄芩苷单药组(P=0.003,P=0.003)。24 h时，对照组愈合率为(72.9±0.7)%，黄芩素组愈合率为(36.2±1.9)%，黄芩苷组愈合率为(32.6±2.5)%，联合应用组愈合率为(21±2.6)%，黄芩素、黄芩苷、联合用药组均低于对照组(P=0.001,P=0.002,P=0.001)，且联合用药组低于黄芩素、黄芩苷单药组(P=0.003,P=0.002)(图2、3)。

2.3 黄芩素、黄芩苷及两药联合时对EMT相关蛋白E-cadherin和N-cadherin的表达影响

免疫荧光结果显示黄芩素、黄芩苷及联合用药时与对照组相比，E-cadherin蛋白的表达升高，N-cadherin蛋白的表达降低。且两药联合组较单药组差异更为显著(图4、5)。

*：P<0.05；**：P<0.01

图2黄芩素、黄芩苷作用于CAL-27的划痕愈合率

Fig.2Scratch healing rates of the effect of baicalein, baicalin and their combination on CAL-27cells

图3 划痕实验检测CAL-27细胞的迁移能力( ×200)

图4 免疫荧光实验观察CAL-27细胞E-cadherin蛋白表达情况

图5 免疫荧光实验观察CAL-27细胞N-cadherin蛋白表达情况

3 讨 论

口腔鳞癌是颌面部高发的恶性肿瘤，目前治疗方法以综合治疗为主，其中晚期患者常发生远处转移，治疗方案多为手术结合放、化疗，其中化疗是现在最为常用的口腔鳞癌辅助治疗方法之一。传统化疗药物在肿瘤治疗中应用广泛且疗效显著，但存在许多不良反应，如骨髓抑制，脱发及恶心、呕吐等胃肠道不良反应。近年来，中药提取物因其安全、低毒、高效的特点在肿瘤治疗方面的应用越来越广泛，其中黄芩素、黄芩苷是从黄芩中提取的黄酮类单体，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等生物学活性，且对正常组织毒性小[13-14]。有研究显示黄芩素、黄芩苷对结肠癌、肺癌、乳腺癌等癌细胞的生长具有抑制作用[15-17]。然而近年来研究者除了关注单药对肿瘤的抑制作用，开始对联合用药进行广泛研究[18]，有报道称在卵巢癌的治疗中，姜黄素和紫杉醇联合应用比单独用药更有效，展现出协同作用[19]。黄芩素、黄芩苷与姜黄素和紫杉醇均为中药提取物，因此，为探究中药间的联合用药对口腔鳞癌的抑制效果，在体外条件下，本研究通过MTT、划痕及免疫荧光实验证实了黄芩素与黄芩苷联合用药可以有效抑制CAL-27细胞的增殖和迁移能力。

黄芩素与黄芩苷可有效抑制CAL-27细胞的增殖，且抑制效果呈浓度依赖性，药物浓度越高，抑制效果越好，当联合用药与黄芩素和黄芩苷的药物浓度相同时，联合用药对CAL-27细胞增殖的抑制作用更好，且CI<1，表明黄芩素与黄芩苷联合应用时具有协同作用。Dou等[20]发现黄芩素与黄芩苷联合应用可有效抑制结肠癌细胞的增殖，这与本实验结果一致。

肿瘤患者生存率低的重要原因之一是肿瘤细胞具有较高的侵袭性和转移性。因此抑制肿瘤细胞转移是提高生存率的关键。近年来，有研究者发现上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤的迁移性研究中具有重要作用，这是一个由正常形态的上皮细胞转化为具有恶性潜能的间充质细胞的过程[21]。其中E钙粘蛋白(E-cadherin)和N钙粘蛋白(N-cadherin)分别为EMT进程中上皮细胞和间充质细胞的标志物。有研究表明，通过改变一些蛋白的表达可以引发或逆转EMT进程，从而影响OSCC的迁移能力[22-23]。闫婉君等[24]研究证明黄芩素通过抑制Snail蛋白的表达阻止EMT发生从而抑制乳腺癌细胞的肝转移，刘海霞等[25]发现黄芩苷可以抗肾小管纤维化，其机制是上调E-钙粘蛋白的表达并抑制TGF-β1途径阻断肾小管细胞转分化。既往实验表明黄芩素、黄芩苷具有抗肿瘤迁移的作用，其机制可能是通过上调或下调EMT相关标志蛋白，抑制EMT进程。这与本实验机制相类似，本研究通过划痕实验和免疫荧光实验验证了黄芩素、黄芩苷及联合用药可有效增强CAL-27细胞内E-cadherin蛋白的表达并抑制N-cadherin蛋白的表达及迁移性，且联合用药对CAL-27细胞迁移的抑制作用强于单药，提示肿瘤细胞恶性程度的降低可能与上皮-间充质转化蛋白的逆向表达有关。

综上所述，黄芩素与黄芩苷联合用药对CAL-27细胞的增殖和迁移具有抑制作用，且抑制效果优于黄芩素、黄芩苷单药。本实验结果为黄酮类药物联合应用抗肿瘤的临床治疗提供了依据，但仍需探索更适宜的联合用药浓度。目前对黄芩素与黄芩苷联合用药的研究仍处在体外实验，体内相关研究及其更多的作用机制有待进一步探索。