基于脂肪酸探究青虾扰动作用对沉积物中有机质降解的影响

封功成，侯诒然，李 冰，季 鹏，骆加伟，陶 冶，张明豪，朱 健，

(1.南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214081；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业农村部淡水渔业和种质资源利用重点实验室，江苏无锡214081)

近年来，随着社会经济的快速发展，传统水产养殖模式中，自然和人为输入养殖池塘中的氮、磷，至少有50%富集到池塘沉积物中[1]。大量沉降在塘底的残饵、粪便、尸体等在腐败分解过程中产生大量有毒物质，直接影响着水产养殖物的存活和生长[2]。底栖动物作为沉积物-水界面的有机组成部分，其生命活动对改变沉积物的理化性质和结构，加速沉积物-水界面间的物质交换，具有非常重要的生态学意义[3]。研究表明，底栖生物摄食、避敌、排泄等行为，会对水体沉积物具有一定的扰动作用，影响有机质、营养盐等各种污染物的迁移转化[4]。Webb等[5]通过对长腕和尚蟹(Mictyrislongicarpus)的研究发现底栖动物的钻孔、筑洞等行为能够加速有机物质的降解；Plante等[6]研究发现底栖动物能够改变微生物群落结构，促进微生物对有机颗粒的降解。

青虾，学名日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)，是一种典型的底栖生物。具有食性杂、生长快、适应性强、营养丰富、养殖经济效益高等特点，是我国淡水虾类的一个重要养殖品种[7,8]。研究表明，通过虾类扰动作用，经再悬浮、矿化分解、释放等过程，养殖池塘底部沉积物中的碳、氮、磷等物质会回到水体中，减少沉积物的有机负荷[9]。因此，青虾不仅是一种重要的养殖经济品种，而且也是一种潜在的生物修复种。

脂类化合物相对于蛋白质和糖类有较高的稳定性，其作为生物标记物在全球碳循环和古海洋学研究中已被广泛应用[10,11]，但在淡水养殖领域中，通过脂肪酸变化指征沉积物中有机质降解的研究鲜有报道。本研究选用青虾作为试验对象，室内模拟池塘养殖环境，通过对沉积物理化性质、脂肪酸组成的分析，探究青虾扰动作用对沉积物中有机质降解的影响，为淡水池塘养殖的绿色可持续发展提供一定的理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验设计

实验在中国水产科学研究院淡水渔业研究中心进行，实验所需青虾和底泥均来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴大浦科研实验基地。选取健康无病、规格一致(3.00±0.10)g的青虾作为养殖对象，在(26.5±0.5)℃水温下，于玻璃缸中暂养14 d。实验设置试验组和空白对照组，每组3个平行，试验在6个长方体有机玻璃缸(63 cm×43 cm×43 cm)进行，玻璃缸中均铺设5.5 cm底泥，为保证底泥的一致性和均一性，所需底泥在使用前需自然晒干，粉碎研磨过100目筛后完全混匀。铺设完成后，统一加水至30 cm，自然沉降14 d，每个玻璃缸中设置3个规格一致的PVC管(直径5.0 cm，长5.0 cm)作为青虾人工巢穴。挑选18只活力充沛青虾，随机放入3个玻璃缸中，每缸6只，饲养90 d。

选用江苏冠乾特种水产饲料有限公司的配合饲料(粗蛋白36%，粗脂肪6%)作为暂养以及实验期间投喂料，具体脂肪酸组成及含量见表1。本实验为严格的单因素对照实验，除青虾外其余实验条件均严格控制一样。实验期间实验组和空白组每天16 ∶00投料一次，将饲料按青虾总重量的3%称取两份，并和少量水混合均匀，每个玻璃缸均匀泼洒投喂；实验期间不进行补水、换水操作，水温保持在(26.5±0.5)℃，并保持连续充氧状态。

1.2 样品采集与处理

实验周期90 d，实验第90天进行样品采集。用2 cm直径的塑料针管式采泥器对玻璃缸内沉积物进行采集，每个玻璃缸中随机选取6个点，采集表层0～1 cm沉积物，将同一玻璃缸中采集的6份样品混合均匀，冷冻干燥研磨过100目筛后，放入样品袋中，放置于-80℃冰箱保存待测。

1.3 指标测定

沉积物中脂肪酸提取与测定参照叶新荣[12]的气相色谱法，并稍作修改。称取约5.0 g沉积物干样于50 mL玻璃试管中，首先加入1.0 mL配制的内标溶液，然后加入15 mL氯仿-甲醇溶液(氯仿/甲醇=2 ∶1，体积比)振荡提取，过滤，再用10 mL氯仿-甲醇溶液重复振荡提取过滤2次，合并滤液并挥干。加入2 mL 0.5 mol/L氢氧化钠-甲醇溶液，60 ℃水浴30 min，冷却至室温。加入2 mL 25%三氟化硼-甲醇溶液，60 ℃水浴20 min，冷却至室温。加入2 mL正己烷和2 mL饱和氯化钠，振荡萃取，静止分层。小心吸取上层正己烷和脂肪酸甲酯混合物，用微量进样器吸取1μL注入气相色谱仪(岛津Nexis GC-2030，日本)，采用火焰电离检测器。最后，根据标准脂肪酸出峰时间确定脂肪酸种类，通过内标法测定脂肪酸含量。

沉积物中有机碳(TOC)及总氮(TN)含量测定参照白亚之[13]的沉积物TOC和TN分析方法。将沉积物样品加入5%的稀盐酸多次搅拌后在低温水浴环境中静置3 h以上，以便完全去除碳酸盐。然后将样品置于离心管内，用蒸馏水离心清洗，使其呈中性，低温干燥去除碳酸盐的样品，研磨至粉末状。取10 mg的样品，通过元素分析仪(EA3000，意大利)测定TOC及TN含量，其中TOC、TN分析误差小于0.5%。

沉积物含水率(moisture content，MC)采用105 ℃烘干恒重法测定(GB/T50123-1999)；沉积物pH和氧化还原电位(oxidation-reduction potential，ORP)选用METTLER TOLEDO InLab®进行测定。

1.4 数据计算

1.4.1 含水率

沉积物含水率(MC)按下式计算：

式中：W1—烘干前样品重量(g)；

W2—烘干后样品重量(g)。

1.4.2 脂肪酸降解参数

脂肪酸降解参数主要包括：脂肪酸的平均碳链长度(average carbon length，ACL)；短链脂肪酸之和(∑

(1)ACL=∑(zn×n)/∑zn

式中：Zn—具有n个碳的脂肪酸含量

(2)L/H=(C12+C14+C15+C16+C17+C18+C20)/(C22+C24)

(3)C20 ∶1-5/C20 ∶0=(C20 ∶1+C20 ∶2+C20 ∶3+C20 ∶4+C20 ∶5)/C20 ∶0

1.4.3 碳氮比

沉积物碳氮比(C/N)[16]公式如下：

C/N=TOC/TN

1.4.4 有机指数

为评价水环境沉积物有机污染状况，引入有机指数(organic index，OI)[16]，其公式为：

OI=WTOC×WTON

WTON=TN×0.95

式中：OI为有机指数；WTOC为有机碳质量分数；WTON为有机氮质量分数；TN为总氮含量。

1.5 数据处理

本文使用Excel、GraphPad Prism6进行常规数据计算、相关性分析及作图，并使用SPSS 20.0 统计分析软件对实验数据进行单因素方差分析(One way ANOVA)及相关性分析，用Duncan’s多重比较分析组别的差异显著性，P<0.05则为有显著差异，P<0.01则为有极显著差异，实验数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示，在数据统计分析前，实验数据要进行正态性和方差齐性检验。

2 结果

2.1 沉积物理化性质

表2为第90天实验组与空白组沉积物pH、ORP及MC分析结果，从表中可以看出，实验组与空白组沉积物pH、ORP及MC均存在显著差异，其中pH与ORP呈极显著差异，MC呈显著差异。实验组pH较空白组显著降低0.93，ORP较空白组显著增加54.34，MC较空白组显著增加6.59%。

表2 沉积物理化参数Tab.2 Physical and chemical parameters of sediments

注：*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)，下同。

2.2 沉积物脂肪酸组成及降解参数

2.2.1 沉积物脂肪酸组成及其含量

将沉积物中游离态脂肪酸(fatty acid，FA)分为饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)、多不饱和脂肪酸(PUFA)。由表3可见，本实验鉴定出沉积物中18种脂肪酸，所有样品均显示以低碳数脂肪酸占绝对优势，SFA为9种，MUFA为4种，PUFA为5种。其中，实验组SFA、MUFA及PUFA分别占实验组FA的58.57%、35.45%及5.98%，空白组SFA、MUFA及PUFA占空白组FA的57.06%、32.16%及10.78%；实验组FA、SFA及PUFA含量较空白组显著降低81.60 μg/g、45.39 μg/g及12.53 μg/g。

表3 沉积物脂肪酸组成及含量(干重)Tab.3 Composition and content of fatty acids in sediments(dry weight) μg/g

2.2.2 脂肪酸降解常数

沉积物脂肪酸降解参数主要为ACL,L/H，C20 ∶1-5/C20 ∶0。其中实验组ACL为17.46±0.01，空白组为17.30±0.05，存在极显著差异；实验组与空白组L/H分别为：8.91±2.09、9.43±0.66；实验组C20 ∶1-5/C20 ∶0为0.97±0.11，空白组为0.97±0.11，无显著差异。

结合沉积物理化参数，分析脂肪酸降解参数ACL与MC、ORP之间的关系，ACL与MC呈显著正相关(MC=39.76ACL-614.6，R2=0.8126，n=6，P<0.05)，与ORP呈显著正相关(ORP=290.3ACL-5179，R2=0.7756，n=6，P<0.05)。

2.3 沉积物碳氮含量及有机指数

表4 沉积物碳氮含量及有机指标Tab.4 Carbon and nitrogen content and organic index in sediments

注：有机污染评价标准参考文献[16]：OI≥0.50为有机污染；0.20≤OI<0.50为尚清洁。

实验组与空白组沉积物碳氮含量及有机指数如表4所示，其中TOC和TN含量差异不显著；实验组和空白组C/N存在显著差异，实验组C/N较空白组显著降低0.25。实验组与空白组沉积物OI计算结果如表4所示，实验组沉积物OI均值为0.48，空白组沉积物OI均值为0.53，实验组沉积物处于尚清洁状态，空白组沉积物处于有机污染状态,这表明青虾扰动作用对养殖环境沉积物有机污染状况起到一定的改善作用。

3 讨论

3.1 脂肪酸组成

实验结果表明，实验组与空白组沉积物中C16 ∶0含量占脂肪酸总含量比例最大，产生这种现象的主要原因有以下两点：一是由于C16 ∶0来源主要包括藻类和微生物[17]，沉积物中微生物除了通过去饱和等一系列过程将C16 ∶0转化成各种不饱和脂肪外，还能够通过碳链的延长合成不同形式的脂肪酸，这种延长往往在合成到C16 ∶0后终止，由于C16 ∶0在新陈代谢过程中的独特地位，使其在沉积物中具有积聚并且较长时间以较高浓度存在的可能[18]，二是C16 ∶0是长链脂肪酸氧化降解的产物[19]。在这两个过程共同作用下，沉积物中C16 ∶0含量最高现象是合理的。

研究结果显示，青虾扰动作用显著降低沉积物中FA、SFA、PUFA含量，与Ding等[20]研究结果类似；孙立群等[18]通过模拟试验研究刀额新对虾(Metapenaeusensis)对微藻脂肪酸在沉积物中降解影响时发现，刀额新对虾扰动作用能显著加快藻类中脂肪酸降解。实验组C16 ∶1含量较空白组存在显著差异，但MUFA较空白组无显著差异，与不饱和脂肪酸较饱和脂肪酸更易降解的研究结论不一致[19]，其原因可能是沉积物及饲料中MUFA含量相对较低、室内模拟试验的局限性等造成的。

3.2 脂肪酸降解参数

众多研究表明，沉积物游离态脂肪酸降解参数ACL、C20 ∶1-5/C20 ∶0和L/H一定程度上可以反应沉积物有机质的降解变化[14,15]。短链脂肪酸相对于长链脂肪酸更易降解[21]，易于降解的短链脂肪酸的减少以及长链脂肪酸的选择性富集，导致脂肪酸降解参数ACL值会随沉积物有机质降解程度的增加而升高[22]。本研究结果显示，实验组ACL明显大于空白组，这表明青虾扰动作用促进沉积物有机质的降解，与李芳芳[21]研究结果类似。不饱和脂肪酸的化学键易断裂，使得沉积物中不饱和脂肪酸含量减少，从而导致C20 ∶1-5/C20 ∶0值的减少[23]。本实验中L/H以及C20 ∶1-5/C20 ∶0值无显著差异，未产生差异可能与实验周期长短、指标适用性和敏感程度不同及室内模拟实验的局限性等因素有关。

3.3 沉积物理化参数

青虾扰动作用能显著增加沉积物含水率，分析原因是青虾的摄食、爬行等扰动作用使沉积物表层变得疏松，促进了沉积物-水界面的物质交换，使得沉积物有较高的含水量，这与张雷等[24]研究一致。其他研究表明，生物扰动作用能显著增加沉积物的含水率及总微生物活性，从而促进沉积物中有机质的降解[25,26]。实验组ORP显著大于空白组，其原因可能是生物体通过摄食和爬行等活动产生的扰动作用可以增加沉积物中的氧含量，提供更多的电子受体，提高沉积物的ORP[27]；吴金浩等[28]研究表明，沉积物ORP与有机质含量呈负相关，即沉积物较强的氧化状态是其有机质降解的有利条件。本实验中青虾扰动作用促使沉积物pH显著降低，这与李耀睿等[29]研究结果一致，分析原因可能有以下几点：较多氧气进入沉积物后，加速沉积物中有机物的有氧分解，产生较多CO2；沉积物氧化作用提高，硝化作用增强需消耗碱性物质，进而导致pH下降；低价金属(Fe2+和Mn2+)发生氧化反应，导致沉积物酸化；沉积物释放的铁锰离子与OH-的结合作用大于H+和OH-的结合作用，因此其水解作用使得沉积物中H+增加，导致pH值较低[30,31,32]。通过相关性分析，结合ACL指征作用，青虾扰动作用显著提高沉积物MC和ORP，为促进有机质降解创造有利条件。

3.4 沉积物碳氮含量

TOC是描述沉积物有机质含量的重要指标，C/N除了能有效指示沉积物有机质来源外，还能描述沉积物有机质分解速度。Nickell等[33]研究表明，C/N低意味着沉积物中含有较高的不稳定有机物，其含量的增加有利于有机质的矿化反应，C/N的变化与有机质分解速度之间呈反比关系[34]。本研究结果显示，青虾扰动作用显著降低沉积物C/N，增强沉积物中有机质的降解程度，与李芳芳[21]研究结果类似。实验组与空白组沉积物TN和TOC均无显著差异，可能与实验周期较短有关。青虾除通过扰动作用改变沉积物微环境来促进沉积物中有机质降解外，其摄食行为也能造成沉积物中有机质含量的减少，以及在沉积物表层爬行等活动可能造成沉积物的再悬浮，一些不能被摄食的食物杂质会被直接喷射到上层水体中，造成上层水体的浑浊，部分饲料残饵及少量沉积物也由此转移到上层水体中，Webb等[5]研究生物扰动时发现底栖甲壳动物能够扩大溶质运输、加速有机物降解。影响沉积物有机质降解的因素除扰动、氧化还原环境、酸碱度及含水率外，沉积物中矿物含量、颗粒粒径大小、微生物含量及活性等因素也可能对有机质的保存与降解起着重要的控制作用，有待于进一步研究以便更好解释沉积物中有机质的保存与降解机理[35]。

综上所述，青虾扰动作用改变了沉积物的MC、ORP等理化指标，为沉积物中有机质的降解创造了有利条件。同时，ACL值的差异性也说明青虾扰动作用可以促进沉积物中有机质的降解，从而在一定程度上避免因沉积物中有机质过度积累所导致的养殖环境有机污染的风险。但不可忽视的是，实验组和空白组脂肪酸降解参数中，L/H与C20 ∶1-5/C20 ∶0指标无显著差异，可能与实验周期长短、指标适用性和敏感程度不同等因素有关，实验室模拟试验为下一阶段野外实验时，更好的开展针对性实验和分析提供宝贵经验。