基于液质联用技术的肺痹汤有效成分测定及药代动力学特征初探

郝庆勋 李国栋 韦婉 谢洁 焦扬

“肺痹汤”为首都国医名师周平安教授治疗间质性肺疾病的常用经验方，可明显改善特发性肺纤维化患者咳嗽、气短等呼吸道症状，并有效地减少年平均肺部感染次数，提高生存质量，延长生存期。全方以益气解毒，化痰通络为法，由生黄芪、金银花、浙贝母、丹参等组成，寒热并用，补中寓通，共奏益气解毒活血、清热化痰通络之功效。本课题组前期在动物实验中发现，肺痹汤具有抗博来霉素大鼠肺纤维化作用，其主要机制可能是肺痹汤可降低博来霉素大鼠血清中细胞外基质含量[1]；在体外实验中，本课题组发现肺痹汤及其主要成分对人胚肺成纤维二倍体细胞(medical research council cell strain 5，MRC-5)的增殖具有抑制作用[2]。为进一步明确肺痹汤水煎剂及入血成分，本实验基于液相色谱-串联质谱法技术(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)，测定肺痹汤水煎剂及灌胃大鼠体内血药浓度变化，研究口服肺痹汤后其主要成分在大鼠体内的代谢变化，为该方治疗间质性肺疾病提供实验依据，为临床合理用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠19只，雌雄不限，SPF级，体重(250±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证编号：SCXK(京)2016-0006，合格证号：11400700248337。所有动物均适应性喂养一周后使用。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 肺痹汤的组成：生黄芪、金银花、浙贝母、丹参、当归、穿山龙、生甘草，购自北京同仁堂饮片有限责任公司，经鉴定为正品，符合《中华人民共和国药典》要求。肺痹汤水煎剂由北京中医药大学东方医院药房按照质量比3∶3∶2∶2∶2∶2∶1比例，浓煎成生药浓度为2.83 g/mL的复方制剂，置于4℃冰箱中低温保存。检测时将肺痹汤水煎剂稀释4倍(取5 mL复方制剂加入15 mL超纯水，置于涡旋机混匀)，取出1 mL稀释液于EP管中，置于高速冷冻离心机内离心处理(1400 rpm，10 min，4℃)，离心完毕后取80 μL上清液进行质谱检测。对照标准品：芒柄花甘(批号：OB12877)，绿原酸(批号：OB12831)，贝母素乙(批号：OB12894)，甘草酸(批号：OB12897)，甘草苷(批号：OB12809)，薯蓣皂苷(批号：OB12823)，丹酚酸B(批号：OB12871)，环黄芪醇(批号：OB12803)，丹参酮IIA(批号：OB12852)，肉桂酸(批号：OB12834)，均购自北京欧北生物科技有限公司，纯度均≥98%。乙腈、甲酸为色谱纯；甲醇为分析纯(美国Fisher公司)。实验用水为超纯水。

1.2.2 仪器 UPLC分析检测肺痹汤水煎剂(美国Waters SYNAPT G2仪)；UPLC分析检测肺痹汤灌胃大鼠含药血浆(美国Waters ACQUITYUPLC仪)；涡旋振荡器(型号VORTEX-5)；R200D型电子分析天平(德国Sartorius公司)；UV型超纯水机(美国Millipore公司)；ME235S电子分析天平(德国Sartourious公司)；高速冷冻离心机(型号：Centrifuge 5427 R，上海年悦仪器公司)；可视氮吹仪(型号KD200，上海沪粤明科学仪器有限公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，20 mL、100 mL Research plus移液枪(德国 Eppendorf公司)。

1.3 溶液的制备

标准品溶液制备：天平精准称量甘草苷、甘草酸、贝母素乙、环黄芪醇、绿原酸、芒柄花甘、肉桂酸、丹酚酸并用纯甲醇溶解，配成标准品储备液，再用甲醇溶液稀释成1600 ng/mL、800 ng/mL、400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、20 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL的工作液，贮藏在4℃冰箱中冷藏待用。

1.4 色谱条件

1.4.1 肺痹汤水煎剂检测色谱条件 以0.1‰甲酸-水(A)和乙腈(B)为流动相，分离色谱柱为ACQUITY UPLC®BEH C18 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm)。柱温45℃，流速0.4 mL/min，进样体积2 μL。梯度洗脱程序为：0～10 min，5%→20% B；10～15 min，20%→95% B；15～20 min，95% B；20.1～25 min，5% B。

1.4.2 肺痹汤灌胃大鼠含药血浆检测色谱条件 以0.1‰甲酸-水(A)和甲醇(B)为流动相，分离色谱柱为ACQUITY UPLC®BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。柱温40℃，流速0.3 mL/min，进样体积2 μL。梯度洗脱程序为：0～1 min，5% B；1～3 min，5%→50% B；3～4 min, 50%→95% B；4～5 min，95% B。

1.5 质谱条件

1.5.1 肺痹汤水煎剂检测质谱条件 质谱分析使用UPLC-Q-TOF质谱仪。实验参数：毛细管电压2.7 kV，离子源温度120℃，锥孔电压：40 V，脱溶温度400℃，脱溶气体流量800 L/h。

1.5.2 肺痹汤灌胃大鼠血浆检测质谱条件 质谱分析使用Xevo TQ-S质谱仪(Waters，Milford，MA，USA)。实验参数：毛细管电压2.5 kV，脱溶温度400℃，脱溶气体流量800 L/h，锥形气体流150 L·h-1，采用多反应监测的质谱扫描方式；测定芒柄花甘检测离子；m/z 475.1583-267.1373；甘草苷检测离子：m/z 417.2221-255.1298；绿原酸检测离子：m/z 353.1908-191.1373；内标的检测离子：m/z 147.2119-103.1623；用进样器取20 μL供试品，注入高效液相仪。每种分析物的碰撞能量和锥电压根据多重反应监测设定。定量数据由Waters Mass Lynx TM Software 4.1获取和处理。

1.6 肺痹汤灌胃大鼠血浆制备

1.6.1 单次给药组 SD大鼠19只，随机选取7只作为单次给药组，实验前12小时禁食，自由饮水。按10 mL/kg给大鼠以肺痹汤水煎剂灌胃。单次给药组灌胃1次后开始采血。于灌胃后0 h、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h经股动脉插管采血0.5 mL，共12次，放置于肝素化EP管中，以4000 rpm于高速冷冻离心机中离心10分钟，完毕后取上层血浆200 μL，放置于-20℃冰箱待测。

1.6.2 给药7天组 SD大鼠19只，随机选取7只作为给药7天组，实验前12小时禁食，自由饮水。按10 mL/kg给大鼠以肺痹汤水煎剂灌胃，连续给药7天，每日1次。于第7次灌胃后0 h、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h经股动脉插管采血0.5 mL，共12次，放置于肝素化EP管中，以4000 rpm于高速冷冻离心机中离心10分钟，完毕后取上层血浆200 μL，放置于-20℃冰箱待测。

1.6.3 空白对照组 SD大鼠19只，随机选取5只，灌胃等量生理盐水7天，末次灌胃后1小时经腹主动脉采血，每只采血量约5 mL，室温下静置4小时后离心(4℃，4000 rpm，15 min)，分离上清液约20 ml，放置于-20℃冰箱待测。

1.7 血浆样品处理方法

室温下融化血浆样品，精确吸取100 μL样品，加入20 μL内标肉桂酸溶液，涡旋混匀，再加入300 μL甲醇沉淀蛋白，将沉淀蛋白后溶液置于离心机中，以14000 rpm离心10 min，取上清液，于30℃氮吹仪中氮气吹干，用100 μL甲醇复溶，涡旋混匀后，与高速冷冻离心机中以14000 rpm离心10 min，取上清液进行质谱检测。

1.8 方法学质控样品制备

1.8.1 精密度与重复性质控样品制备 分别制备芒柄花甘、绿原酸、甘草苷的低、中、高浓度为20、200和1200 ng/mL 的血浆质控样品，按照血浆样品处理方法准确处理样品，每个浓度分别平行制备3份，重复3个批次。根据每批的当日标准曲线计算质控样品所测定浓度的相对标准偏差值(relative standard deviation，RSD)，从而考察精密度与重复性。

1.8.2 基质效应与回收率质控样品制备 分别制备芒柄花甘、绿原酸、甘草苷的低、中、高浓度分别为20、200和1200 ng/mL的血浆质控样品，按照血浆处理方法，每个浓度分别平行制备3份，以低、中、高3个浓度的大鼠血浆样品测得的峰面积与大鼠空白血浆经蛋白沉淀处理后加入相应浓度的对照品溶液的峰面积之比，计算回收率RSD值。以上述大鼠空白血浆加入对照品溶液的峰面积与对应浓度的对照品溶液的峰面积之比，计算方法的基质效应RSD值。

1.8.3 稳定性质控样品制备 分别制备芒柄花甘、绿原酸、甘草苷的低、中、高浓度分别为20、200和1200 ng/mL的血浆质控样品，每个浓度分别平行制备6份，按照血浆处理方法，将处理好的质控样品于室温下分别放置0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，按照血浆检测色谱的条件分别上机检测，记录峰面积并计算相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.9 统计学处理

所得血药浓度—时间数据以Phoenix WinNonlin 7.5软件计算药动学参数，由 Microsoft excel 2010进行数据整理和制图。

2 结果

2.1 标准曲线制备

分别取100 μL空白大鼠血浆依次加入100 μL浓度为1、5、20、50、200、400、800、1600 ng/mL的系列混合对照品溶液和20 μL内标溶液，按照血浆样品处理方法对样品进行处理和测定，每个浓度平行制备3份样品，每条标准曲线包含8个浓度。分别以对照品浓度(X)为横坐标，以对照品峰面积与内标峰面积比值(Y)为纵坐标，用加权(1/C)最小二乘法进行线性回归，建立各成分在大鼠血浆中的标准曲线。结果表明:芒柄花甘血浆药物浓度的回归方程为：y=34.3544x+665.491，r=0.996；绿原酸回归方程：y=61.4076x+18187.6，r=0.998；甘草苷回归方程：y=134.778x+362.923，r=0.995；(权重=1/X2)。线性范围为1～1600 ng/mL。定量下限为1 ng/mL。

2.2 方法学实验结果

将“1.8”中各组血浆质控样品按照相应方法条件检测后，得出实验结果，见表1。

2.3 肺痹汤及血浆质量控样品检测图谱

取上述肺痹汤水煎剂上清液，空白血浆上清液，含药血浆上清液按条件进行检测。结果表明，通过将肺痹汤水煎剂与“1.1”中制备的标准品溶液进行相对分子质量比对后，共得出9种有效成分，包括甘草苷、甘草酸、绿原酸、丹参酮、芒柄花甘、贝母素乙、环黄芪醇、丹酚酸B、薯蓣皂苷。色谱图见图1。

表1 方法学实验结果

将大鼠灌胃7天的含药血浆图谱与“1.3”制备的标准品对照液进行相对分子质量比对后，得出3种入血成分，分别是：芒柄花苷、绿原酸、甘草苷。对比后发现三种化合物的表达时间分别是：芒柄花甘为9.1分钟，绿原酸为1.19分钟，甘草苷为5.1分钟，空白血浆中内源性杂质及其他杂质不干扰血浆样品的测定，其他峰可能为代谢产物。色谱图见图2。

2.4 大鼠含药血浆药代动力学参数测定

2.4.1 单次给药组 单次给药组的血浆，按照血浆样品条件进行处理，计算血药浓度，通过Phoenix WinNonlin 7.5软件计算药代动力学参数，结果见表2。

表2 单次给药组药代动力学参数

2.4.2 给药7天组 给药7天组的血浆，按照血浆样品条件进行处理，计算血药浓度，通过Phoenix WinNonlin 7.5软件计算药代动力学参数，结果见表3。

注：A甘草苷；B甘草酸；C绿原酸；D丹参酮；E芒柄花甘；F贝母素乙；G环黄芪醇；H丹酚酸B；I薯蓣皂苷图1 肺痹汤水煎剂九种有效成分图谱

注：A大鼠空白血浆；B大鼠灌胃7天血浆。图2 大鼠空白血浆和大鼠灌胃7天血浆图谱

表3 给药7天组药代动力学参数

3 讨论

目前中药血清药理学研究主要针对单味药，以中药复方为研究对象的尚不多见。在临床工作中，中药治疗间质性肺疾病疗效肯定[3]。本课题组的前期研究表明，肺痹汤含药血清可抑制成纤维细胞的增殖，减少TGF-β1的分泌，阻断TGF-β1/Smad信号通路，从而减少胶原的合成与分泌，减轻纤维组织的增生[2]。肺痹汤方中以生黄芪为君，具有补肺益气，益卫固表功效；金银花为臣，辛散宣透，清热解毒，通络散结，切合肺纤维化肺络痹阻的病机；生黄芪、当归相配伍补气行血，益气以行血通络；浙贝母可清热化痰，散结开郁；丹参活血祛瘀，安神除烦；穿山龙祛风除湿，止咳化痰，活血通络，诸药配伍可益气解毒，化痰通络。处方中生黄芪主要成分之一为芒柄花甘，具有调节机体免疫功能，拮抗病毒作用[4-5]；金银花主要成分为绿原酸，具有抗菌抗病毒，抗炎解热作用[6-7]；生甘草中甘草苷具有镇咳平喘、抗炎、调节机体免疫功能作用[8-9]。有关实验表明穿山龙主要成分薯蓣皂苷元可以降低MRC-5细胞增殖，起到抗纤维化作用[10]。肺痹汤经过多年临床实践，可明显改善特发性肺纤维化患者咳嗽、气短等呼吸系统相关症状，有效地改善了患者的生存质量[11-12]。

LC-MS是现代药物研究中不可或缺的技术，尤其以分离度高、灵敏度高、专属性强、速度快等优势广泛应用于中药化学成分的研究。在前期的临床与实验研究基础上，本研究为进一步明确肺痹汤有效物质基础，参照生物利用度和生物等效性试验的指导原则及相关实验方法，建立了LC-MS方法。实验结果表明，肺痹汤中的生黄芪、金银花、生甘草等药物的有效成分可以在大鼠血浆中测出，可见，本方的临床疗效具有明确的药物化学物质基础。

本实验优化了肺痹汤中相关成分的检测条件，在ESI离子化方式下，芒柄花甘、绿原酸、甘草苷在负离子模式检测的响应高于正离子模式下的响应。此方法便于快速检测灌胃复方后的大鼠体内肺痹汤的有效成分。在对样品进行预实验处理时，由于肺痹汤检测成分都为水溶性的物质，极性较大，查阅相关资料发现，水溶性大的物质若采用液-液萃取的方法其提取率较低，本实验使用甲醇蛋白沉淀的方法方便快速，可以得到较为理想的质谱响应。

本研究为肺痹汤药效物质基础研究提供了一定实验依据，为进一步开展治疗机制研究奠定基础。通过药代动力学参数分析后可知，给药7天组与单次给药组比较，AUC0-t、Cmax明显增高，MRT0-t显著升高，t1/2显著延长，CLz/F明显减少。由此推论，肺痹汤多次给药可以提高复方有效成分在体内暴露量，所以在临床上肺痹汤治疗间质性肺疾病适宜长期服用，从而增加有效成分在体内的蓄积，更好地发挥治疗作用。