间接竞争ELISA法检测黄连解毒汤中黄芩苷在大鼠脑脊液中的分布

刘佳星 赵琰 王苏娜 王晓克 罗娟 孔慧

黄连解毒汤最早源于葛洪《肘后备急方》卷二“治伤寒时气温病方第十三”，但未出方名[1]，距今1700多年的历史，是清热解毒的经典方剂[2]。其异名在《脉因证治》上称火剂汤、《医学心悟》中称三黄解毒汤。黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子4味中药材按3∶2∶2∶3比例配伍组成，以黄连泻心火兼泻中焦之火为君，黄芩清肺热、泻上焦之火为臣，黄柏泻下焦之火，栀子通泻三焦之火、导热下行，合为佐使，共收泻火解毒之功,用治大热烦躁，口燥咽干，错语不眠；或热病吐血、衄血；或热甚发斑，或身热下利，或湿热黄疸；或外科痈疡疔毒,小便黄赤，舌红苔黄，脉数有力。无论内服、外服，均有良好的治疗作用[3-4]。

黄连解毒汤的现代研究表明，它对多种感染性疾病[5]、内分泌代谢性疾病以及一些免疫系统疾病[6]都有良好的临床疗效。对于缺血性中风[7]、颈动脉斑块[8]、阿尔茨海默病、2型糖尿病[9]等亦有很好的治疗作用。

药代动力学方面的研究在一定程度上揭示了黄连解毒汤中黄芩苷的作用机理，但是相对而言，黄连解毒汤治疗脑部中风和一些神志方面的疾病时，是否对靶部位有直接作用、其有效成分是否可以透过血脑屏障、在脑中的代谢情况又是如何等问题至今未见报道。药物到达靶部位是药物起效的关键方式之一，这其中已有研究表明栀子苷可以透过血脑屏障[10]，通过抗氧化[11-12]等方式改善脑缺血导致的一些症状，那么黄芩苷作为黄连解毒汤中黄芩的主要成分之一，是否也能够透过血脑屏障直接对脑部产生作用，是本实验需要解决的问题。

因此本论文在大鼠灌胃给药后1小时、2小时、3小时、4小时四个时间点分别抽取脑脊液，用icELISA法检测黄芩苷在脑脊液中的含量，用以观察黄连解毒汤中黄芩苷在脑脊液中的代谢情况，在一定程度上可以反映黄连解毒汤在脑部的分布特征。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

HC-2518R高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.，Ltd)；96孔酶标板(NVNC丹麦赛默飞公司)；酶标仪(BioTek美国博腾仪器有限公司ELx800酶标仪)。

1.2 试剂

黄连解毒汤制备药材购于北京仟草中药饮片有限公司，黄芩苷对照品(Shanghai Standard Biotech Co，Ltd批号：1596/10595，纯度≥98.0%)；其他相关药品如碳酸盐和Tween-20等均为国产分析纯；酶标二抗(HRP标记羊抗鼠IgG，GeneScript公司)；四甲基联苯胺(TMB，美国Amercso公司)。

1.3 样品制备

黄连解毒汤的制备按黄连解毒汤的处方比例，分别称取黄连、黄芩、黄柏、栀子四味药材各90 g、60 g、60 g、90 g，加水6倍量，煎煮三次，每次1.5小时，滤过，滤液浓缩至稠膏(1.37 g/mL原药材)。

1.4 样品采集

50只Sprague-Dawley(SD)健康大鼠(220±10)g，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK(京)2012-0001。

将健康的SD大鼠随机分为5组，分别是1小时组、2小时组、3小时组、4小时组，每组6只，以及空白组26只，进行试验。

给药剂量：SD大鼠按人公斤体重的6倍量进行折算，为了保证在脑部组织能够检测出黄芩苷，大鼠的给药剂量是折算剂量的5倍，每只大鼠灌胃2.5 mL。

实验前禁食不禁水12小时，将制备好的黄连解毒汤灌胃给药，分别于给药后1小时、2小时、3小时、4小时抽取脑脊液。

脑脊液抽取：采用手持大鼠头部固定体位的脑脊液抽取方法。将大鼠用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，麻醉后将头颈部所需部位鼠毛剃除干净，参照任长虹报道大鼠脑脊液抽取方法并进行改进[13]，将大鼠的头部按角度固定在脑固定仪上，采样者手持1 mL注射器进针，进针角度与头部成约135°角。针尖坡面向上缓慢向前进针到小脑延髓池，深度约为0.5 cm。缓慢抽取80～100 μL脑脊液后迅速退针，将脑脊液注入1.5 mL的EP管中，置-40℃冰箱储存备用，大鼠处死。

1.5 icELISA法检测黄芩苷

1.5.1 黄芩苷标准溶液的制备 精密称取黄芩苷约5 mg，PBS溶解，配成100 μg/mL的母液。取母液50 μL，加脑脊液稀释至10 μg/mL，然后用脑脊液依次5倍稀释，直至稀释到3.2 ng/mL，获得浓度范围从3.2～2000 ng/mL的系列标准溶液。

1.5.2 icELISA检测步骤 实验前所有试剂室温平衡30分钟；用CBS(碳酸盐缓冲液0.05 mol/L，pH为9.6)稀释包被原BAL-BSA(1∶5000)，以100 μL/孔包被到96孔板，37℃孵育2小时，用PBST洗板4次后，再用脱脂奶粉(5 g溶于100 mL去离子水中)250 μL/孔封闭。放入4℃冰箱过夜，PBST洗版3次，备用。

向包被好的96孔微孔板中加入待测样品或黄芩苷标准溶液50 μL/孔，空白孔加入等量空白脑脊液，放入37℃温箱孵育1小时，取出后PBST洗板3次；以黄芩苷对照品质量浓度为0的测定孔为阳性对照孔，加入以PBS按照1∶10000稀释的酶标二抗，每孔100 μL，于37℃温箱孵育30分钟；取出后用PBST洗板3次，每孔加入100 μL的TMB显色液，37℃温箱显色15分钟；以2 mol/L硫酸溶液50 μL/孔终止反应。将整块微孔板置于酶标仪，测定各孔在波长450 nm处的吸光度A值。

1.6 方法学考察

1.6.1 线性关系 取以上配制的浓度范围从3.2～2000 ng/mL系列黄芩苷标准溶液按以上icELISA检测步骤进行检测。根据检测结果，以A/A0(A0为空白孔OD值，A为检测孔OD值)为y轴，黄芩苷浓度的自然对数为x轴，建立竞争抑制曲线，计算线性范围。

1.6.2 精密度 取以上标准溶液中400 ng/mL、80 ng/mL和3.2 ng/mL 3个浓度的黄芩苷标准溶液，按照以上的icELISA检测步骤进行测定，每个浓度设5个平行孔，每条标曲用1块板测定，得出板间精密度。

1.6.3 回收率 在空白大鼠脑脊液中定量加入黄芩苷标准品，配制成浓度为400 μg/mL、80 μg/mL和3.2 μg/mL的黄芩苷脑脊液溶液，每个浓度设5个复孔检测。回收率计算公式如下：回收率=(黄芩苷检测浓度/黄芩苷加入浓度)×100%。

1.6.4 样品检测 取脑脊液室温溶解，置高速离心机内10000 rpm，离心4分钟，温度4℃，取上清液，加入包被好的96孔板，按以上检测步骤进行检测。

2 结果

2.1 线性关系

以A/A0(A0为空白孔OD值，A为检测孔OD值)为Y轴，黄芩苷浓度的自然对数为X轴，建立竞争抑制曲线，线性拟合回归方程为：y=0.1069ln(x)+1.0144，R2=0.9885。见图1。

图1 黄芩苷在脑脊液中的线性关系

2.2 精密度

通过检测，得出精密度见表1。从表1可以看出，小鼠脑脊液中高、中、低3种浓度黄芩苷含量检测的精密度分别为13.14%、6.65%、6.04%，数据均≤15%，能够满足检测需求。

表1 icELISA法测定不同浓度黄芩苷标准溶液的精密度

2.3 回收率

按照回收率计算公式：回收率=(黄芩苷检测浓度/黄芩苷加入浓度)×100%,测得结果见表2。从表2可以看出，检测高、中、低3个浓度血浆溶液中黄芩苷的回收率分别为91.35%、87.04%和117.67%(SD≤15%)，均在±20%之内，可以满足生物样品的检测要求。

表2 icELISA法测定不同浓度黄芩苷血浆溶液中标准溶液的回收率

2.4 样品检测

从给药后1小时、2小时、3小时和4小时脑脊液中黄芩苷的平均含量可以看出，在给药2小后黄芩苷在大鼠脑脊液中含量达到峰值，随后下降，且下降速度较快，在给药4小时后脑脊液中黄芩苷含量最低。见表3。

表3 黄芩苷在脑脊液中的药物分布经时表

3 讨论

黄连解毒汤在治疗多种脑部疾病方面有着切实的临床疗效，其中黄芩苷(7-O-β-D葡萄糖醛酸)作为黄芩的主要有效成分发挥着重要作用。目前黄芩苷药代动力学研究的主要检测手段是高效液相色谱法和质谱法等，但是由于这些方法的样品需要纯化等前处理步骤，对采样量需求较大，难以完成中药复方在脑脊液中的含量检测，这也是一直未见报道黄连解毒汤主要成分黄芩苷在脑积液中分布的原因。本实验从每只大鼠中每次只能获得100 μL左右的脑脊液，样品离心后就可以直接用于检测，不需要进行除蛋白等前处理程序，所以才具有了开展此项研究的可能性。

本实验室前期自制了黄芩苷单克隆抗体，并对抗体的特异性等进行了检测，如果将制备的黄芩苷单抗对黄芩苷的交叉反应率定为100%，结果与黄连解毒汤中含有的主要成分栀子苷、葛根素、大豆苷等的交叉反应率均<0.10%，表明此抗体的特异性良好[14]。而且，黄芩苷在胃肠道几乎不被吸收，需要转化成黄芩素吸收入血，但是在进入血液后又被还原成黄芩苷，故在血液和组织中检测到的仍然是黄芩苷[15]。另外，本实验室基于黄芩苷单克隆抗体建立的ELISA检测方法，与HPLC检测结果一致，详见苏歆等在《药物分析杂志》的报道[16]。

鉴于中药复方成分的复杂性和样品含量相对较低的特点，其组织分布研究一般是取给药后某一个时间点的组织进行检测。虽然像HPLC-MS/MS这种高端仪器设备已经普遍应用于中药药代和组织分布的研究，但是其对样品的制备较为严格和繁琐，限制了其开展广泛的研究。icELISA法具有特异性高、样品处理简单、样品用量少(50 μL就可以满足检测量的需求)、灵敏度高(与液质联用的灵敏度相当)、检测时间快、样品处理量大、对环境无污染等特点，非常适合中药复方的药代动力学和组织分布研究。本实验在以往黄芩苷药代动力学的研究基础上，对采样时间点设计了给药后1小时、2小时、3小时和4小时四个时间点，既能反应黄芩苷在脑部分布的经时特征，又没有牺牲大量动物。

在临床实践中，有时用脑脊液药物浓度水平作为药物脑组织穿透力的证据，甚至有时用脑脊液药物浓度代替感染部位的药物浓度预测疗效[17]。但脑脊液的提取具有一定难度，所以研究相对较少。大量研究表明,黄芩苷对脑缺血具有神经保护作用[17]，但黄芩苷是否可以透过血脑屏障到达作用的靶部位，至今未见报道。本实验利用icELISA检测法首次从脑脊液中检测到了黄芩苷，对黄芩苷能够透过血脑屏障提供了直接的证据。

通过实验，作者证明了黄芩苷可以通过血脑屏障。结合现有研究认为黄芩苷对缺血性脑中风的保护作用可能与抗氧化、抗炎、抗兴奋性毒性和促进神经再生作用有关[18]。因此，本研究为黄连解毒汤治疗中风等疾病的临床应用奠定了一定的实验基础，也为日后治疗脑病疾病合理用药提供了依据。