灯盏花素对缺氧/复氧诱导的皮质神经元凋亡的影响

赵中华，张桃桃，王 慧

0 引言

大脑缺血时诱发氧化应激反应，释放脂质过氧化产物、谷氨酸、兴奋性氨基酸及炎性因子，加重脑组织损伤[1-2]。神经细胞损伤后不可逆，因此，尽快恢复脑组织血流、保证脑组织氧供对神经元突触的重塑及存活有着重要意义。灯盏花素(Scutellarin)是临床常用的脑保护剂，具有减轻组织水肿、改善微循环、抗氧化、扩张血管的作用[3-4]。

缺血性脑卒中是一个复杂的病理生理过程，涉及神经细胞凋亡、氧化应激、炎症反应等多个环节。Bcl-2蛋白属膜整合蛋白，能够阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质，从而抑制细胞凋亡。Bax是重要的促细胞凋亡基因之一，其过度表达可拮抗Bcl-2的保护效应而使细胞趋于死亡。本实验采用缺氧/复氧模式模拟在体脑缺血再灌注损伤，以原代培养的大鼠皮质神经元为研究对象，研究灯盏花素对神经元的保护作用及机制，为其临床应用提供科学的实验资料。

1 材料与方法

1.1 材料 灯盏花素(美国Sigma公司，纯度>99%)，DMEM培养基(北京索莱宝科技有限公司)，CCK-8试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，LDH、SOD、MDA试剂盒(南京建成生物试剂公司)，2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodi hydrofluorescein diacetate，H2DCFDA)荧光探针(美国BD公司)，FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(美国BD公司)，Bcl-2及Bax抗体(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取出生24 h内SD大鼠，置于培养皿中，无菌条件下取大脑皮层，快速剪碎后置于含0.125%胰蛋白酶的PBS液中，37 ℃消化15 min，制备细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清液后将细胞接种于塑料培养瓶中，37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，3～5 d换液1次。

1.2.2 缺氧复氧模型的建立及细胞分组 共分4组，每组5个复孔。①对照组：常规培养。②模型组(神经元缺氧/复氧模型)：细胞置37 ℃培养罐中，缓慢持续通入含有5% CO2+95% N2的混合气体30 min，至罐内氧气含量低于1%，造成神经元缺氧，密封培养罐4 h后，将原来的培养液吸除，重新更换培养液，立即将细胞移至37 ℃、5% CO2的培养箱中继续培养12 h，使细胞复氧。③灯盏花素低、高浓度组：进行缺氧/复氧操作前0.5 h，在培养基中加入溶于DMSO的灯盏花素(1、10 μmol/L)，其余步骤同模型组。

1.2.3 CCK-8法测定神经元细胞增殖 神经元培养于96孔板内，每孔200 μl，细胞密度为1×105/ml，弃去原有培养液，将已配置含10% CCK-8的培养基以换液的形式加入，接种后的96孔板37 ℃培养箱中培养4 h，观察细胞已贴壁。用480 nm吸光度进行检测。

1.2.4 各组细胞上清液LDH及细胞内SOD、MDA检测 收集神经元细胞上清液，严格按照LDH试剂盒说明书检测各组细胞上清液LDH活性；另取各组细胞，裂解后按照SOD、MDA试剂盒的方法进行各样本吸光度值检测。

1.2.5 流式细胞技术检测神经元内活性氧表达 神经元细胞培养于6孔板中，每孔500 μl，细胞密度为1×105个/ml，磷酸缓冲液(Phosphate buffer solution，PBS)冲洗3遍，离心(1 000 r/min)后收集细胞，黑暗中在室温下加入5 μl H2DCFDA染料，15 min后流式细胞仪检测并分析细胞内活性氧表达量变化。

1.2.6 FITC Annexin V细胞凋亡检测 收集细胞后PBS制备细胞悬液，1 000 r/min离心并收集细胞，离心管内加入300 μl缓冲液，混匀后加入5 μl Annexin-V和10 μl PI，避光反应30 min后采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.7 Western blot检测Bcl-2及Bax的蛋白表达水平 收集细胞并提取总蛋白，10 000 r/min离心10 min后取上清，行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后5%的脱脂奶粉4 ℃封闭2 h，加一抗过夜，室温下孵育二抗1 h，ECL化学发光法自显影并采集图像。

2 结果

2.1 灯盏花素浓度对神经元细胞存活率的影响 模型组神经元细胞存活率为36.68%±4.79%，对照组为100.42%±4.55%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。用1、10 μmol/L灯盏花素处理后，细胞存活率逐渐提高，分别为59.87%±4.53%和69.93%±5.27%，与对照组及模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 灯盏花素对神经元细胞存活率的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.2 灯盏花素对缺氧/复氧神经元细胞LDH外漏及SOD、MDA水平的影响 与对照组相比，模型组细胞外培养基中LDH的释放显著增加(P<0.05)。与模型组相比，灯盏花素能够显著降低缺氧/复氧神经元细胞外上清液中LDH水平(P<0.05)，说明灯盏花素能缓解细胞损伤。与对照组比较，模型组神经元细胞内SOD水平降低，MDA水平升高(P<0.05)；与模型组比较，灯盏花素组能显著升高SOD活力，降低MDA水平(P<0.05)，且与浓度相关。其中，灯盏花素高浓度组中LDH及SOD水平与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明灯盏花素可以部分恢复LDH及SOD水平。见表2。

表2 灯盏花素对缺氧/复氧皮质神经元损伤LDH、SOD和MDA的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.3 灯盏花素对神经元细胞内ROS的影响 H2DCFDA荧光探针标记法是一种检测细胞内ROS生成量变化的检查方法，细胞氧化损伤程度越重，主峰越向右侧偏移。流式细胞技术结果显示，对照组细胞内ROS表达均较低，ROS主峰位于基线左侧，模型组DCF荧光信号明显增强，ROS主峰位于基线右侧，不同浓度灯盏花素干预后，荧光信号强度逐渐减弱，ROS主峰向基线左侧移位。见图1。

图1 流式细胞技术检测神经元细胞内ROS改变

2.4 灯盏花素对神经元细胞凋亡的影响 荧光显微镜下，对照组未见明显凋亡细胞，细胞核均为暗蓝色低荧光；模型组细胞核着色不均匀，凋亡细胞呈亮蓝色高荧光；1、10 μmol/L灯盏花素处理后凋亡细胞数量逐渐减少。见图2、表3。

图2 Hoechst染色观察神经元细胞凋亡

2.4 Bcl-2及Bax蛋白表达水平检测 Bcl-2蛋白在模型组中的表达明显降低，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；低、高浓度灯盏花素组Bcl-2蛋白表达逐渐升高，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；Bax蛋白在模型组中的表达明显升高，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；灯盏花素干预可降低Bax蛋白的表达，低、高剂量灯盏花素组Bax蛋白的相对表达量与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)；其中，高剂量灯盏花素组Bcl-2蛋白的相对表达量与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，说明高剂量灯盏花素促进了神经元细胞内Bcl-2表达趋于正常化。见图3、表4。

表3 灯盏花素对神经元细胞凋亡的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

图3 灯盏花素对神经元细胞内Bcl-2及Bax表达的影响

表4 各组Bcl-2及Bax蛋白相对表达比较

组别Bcl-2Bax对照组0.80±0.220.21±0.06模型组0.19±0.12*0.83±0.11*灯盏花素低浓度组0.29±0.16*#0.45±0.10*#灯盏花素高浓度组0.75±0.18#0.39±0.12*#

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3 讨论

临床上，灯盏花素已经用于辅助治疗脑卒中[5-6]。研究表明，灯盏花素通过扩张脑血管改善微循环、恢复缺血病变区血流量等方式复原和改善神经功能；此外，灯盏花素还可减轻脑组织血管损伤和炎症反应，从而减少缺血缺氧对神经功能的损伤，对脑缺血疾病有较好的疗效[5,7]。基于灯盏花素较强的抗氧化损伤作用，可以有效清除自由基，对改善患者生活能力和认知功能有明确效果[6]。

关于灯盏花素对原代培养大鼠神经元缺氧/复氧损伤保护作用的研究不多，徐露等[8]观察灯盏花素联合冰片对缺氧/复氧下原代培养大鼠脑微血管内皮细胞影响，结果显示，两者联合应用可促进ZO-1和Claudin-5蛋白的表达，维持血脑屏障(BBB)紧密连接的完整性。

多种脑血管疾病的损伤机制与神经细胞的缺氧/复氧损伤密切相关[9]。原代培养的神经元缺氧后，谷氨酸递质及嘌呤类代谢产物增加，复氧后在黄嘌呤氧化酶的作用下大量活性氧族(ROS)堆积，ROS水平高低与脑损伤程度直接相关。当ROS水平较高时，神经细胞氧化应激反应增强，细胞损伤加重[10-11]。本研究结果显示，缺氧/复氧破坏了神经元正常生理功能，细胞存活率显著下降。

LDH存在于机体所有组织细胞的胞质内，其含量高低可反映细胞膜的完整性。SOD是细胞内具有抗氧化作用的酶，SOD水平高低反映了机体间接清除氧自由基的能力，两者活力和含量可反映细胞抗氧化的能力。MDA是膜质过氧化最重要的产物之一，它的产生能增加细胞膜损伤，因此，可通过MDA了解膜质过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度。本实验结果显示，灯盏花素预处理能显著降低缺氧/复氧神经元细胞外上清液中LDH漏出率，增加缺氧/复氧神经元细胞内SOD的表达，降低细胞内MDA含量。

H2DCFDA荧光探针是一种检测细胞氧化应激状态的染色方法。本研究采用流式细胞技术观察缺氧/复氧对神经元的氧化损伤程度，观察结果显示，模型组神经元氧化损伤明显，灯盏花素可以不同程度地抑制缺氧/复氧诱导的神经元氧化损伤。

Hoechst 33258染色剂能嵌入凋亡细胞的细胞核DNA，使细胞核浓染，呈致密颗粒和(或)块状蓝色高荧光。本实验中，模型组中亮蓝色荧光明显增多，证实缺氧/复氧可以诱发神经元细胞凋亡，灯盏花素低浓度组及灯盏花素高浓度组中凋亡细胞比例逐渐降低。

脑缺血/再灌注引起的细胞损伤可以通过细胞凋亡的方式导致神经元死亡[12]。Bcl-2在氧化应激介导的细胞凋亡反应中起重要作用，具有潜在的抗凋亡作用[13]。Bax表达水平的高低直接反映细胞凋亡程度，Western blot结果显示，模型组细胞中Bcl-2蛋白表达明显降低，Bax蛋白表达明显增加，提示缺氧/复氧诱导了神经元凋亡，灯盏花素通过改变Bcl-2、Bax蛋白的表达发挥抗细胞凋亡作用。

综上所述，灯盏花素能够有效抑制缺氧/复氧诱导的神经元凋亡，为预防和治疗缺血性脑卒中及退行性神经疾病提供了理论支持。