类风湿关节炎患者血清14-3-3η蛋白及其mRNA表达水平与关节损伤的关系①

周 涛 许超平 肖 颖 张 倩 郑丽芳 (武汉市普仁医院风湿免疫科，武汉 430081)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的自身免疫性疾病，病理表现为关节滑膜炎、软骨降解、骨质破坏等[1]。由于RA可导致关节残疾，严重影响患者日常生活质量；此外，RA还可引起全身并发症，严重威胁患者健康[2]。目前临床以检测患者自身抗体(类风湿因子、抗环瓜氨酸抗体等)水平，并结合影像学检查诊断RA和分型分期，但误诊、漏诊概率较大，延误患者病情[3]。14-3-3蛋白主要表达于真核生物细胞，其分子序列高度保守，是细胞内多种蛋白质的伴侣蛋白，共同调节蛋白质合成、细胞代谢、蛋白质的转运、细胞信号转导及细胞骨架的运输等过程[4]。近几年，国内外研究显示，其亚型14-3-3η蛋白参与类风湿关节炎的发生发展，对RA的诊断及预后有重要作用[5,6]；但14-3-3η蛋白与RA患者关节损伤的关系报道较少，对其作用机制不明。故本文旨在探究14-3-3η蛋白及其mRNA表达水平与关节损伤的关系，为RA患者的辨别和良好预后提供理论基础。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料 选择2017年1月至2018年12月武汉市普仁医院风湿免疫科收治的RA患者158例，参考文献[7]分为早期RA(病程≤1年)80例，非早期RA(病程>1年)78例，另招募同期体检健康者50例为对照组。对照组年龄28～72岁，平均年龄(51.24±12.35)岁；男16例，女34例；平均身高(163.27±6.58)cm，平均体重(57.43±8.62)kg。早期RA患者年龄19～63岁，平均年龄(49.83±11.26)岁；男24例，女56例；平均身高(162.81±7.06)cm，平均体重(58.52±9.14)kg。非早期RA患者年龄21～60岁，平均年龄(51.63±12.84)岁；男23例，女55例；平均身高(162.52±8.09)cm，平均体重(56.22±8.34)kg。3组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，本研究已获得武汉市普仁医院伦理委员会认可，所有受试者均知情且同意参与。

1.1.2仪器 超速离心机(德国Effendrof公司)，ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，超微量核酸分析仪(德国Jena公司)，逆转录试剂盒(美国GeneCopoeia公司)，荧光染料(美国ABI公司)，qRT-PCR仪(美国BioRad公司)，引物序列(由上海信帆生物科技有限公司提供)，3.0T磁共振扫描仪(德国Philips公司)。

1.2方法

1.2.1纳入标准与排除标准 纳入标准：RA患者符合1987年美国风湿病学会提出的RA分类及诊断标准[8]；健康对照组受试者体征正常，各项常规检查无异常；依从性好。排除标准：重要器官(心、肝、肾等)功能障碍；合并糖尿病、甲状腺疾病、血液疾病、恶性肿瘤等慢性病；严重感染；妊娠、哺乳期妇女。

1.2.2临床资料的记录 详细记录研究对象的一般资料(年龄、身高、体重等)。实验室指标包括C反应蛋白(C reactive protein，CRP)、类风湿因子(rheumatoid factor，RF)、抗环瓜氨酸抗体(anti-cyclic citrullinated peptides antibody，抗CCP 抗体)等 。

1.2.3ELISA检测血清14-3-3η蛋白浓度 于早间空腹采集受试者外周静脉血3 ml，应用超速离心机以2 000 r/min离心5 min，上清即为血清，若不及时检测可置于-80℃冰箱冻存。参照ELISA试剂盒说明书步骤，检测血清14-3-3η蛋白浓度。

1.2.4qRT-PCR检测血清14-3-3η mRNA浓度 取出冻存血清，解冻后加入适量Trizol裂解液，提取血清总RNA；经超微量核酸分析仪检测提取物纯度和浓度，参照逆转录试剂盒说明书合成cDNA模板；混入荧光染料，上qRT-PCR仪进行检测，引物序列见表1。参数设置：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸20 s，共35个循环。反应结束后观察溶解曲线判断引物序列特异性，采用2-ΔΔCt法，以GADPH基因的表达量为内参，计算血清14-3-3η mRNA的相对表达量，作3次独立重复试验。

表1 引物序列[9]

Tab.1 Primer sequences[9]

GeneSequenceGAPDHF:GAAGGTGAAGGTGGGAGTR:GAAGATGGTGATGGGATTTC14-3-3ηF:TCGATGATGCCATAGCTGAGR:GCTTCTTCATCCTGCTGGTC

1.2.5RAMRIS系统评分 采用3.0 T磁共振扫描仪检查RA患者受累关节，参照OMERACT RAMRIS评分系统分析 MRI图像，评价患者滑膜炎、骨髓水肿、骨侵蚀等关节损伤，具体细则如下：①滑膜炎评分，正常为0分，强化范围为滑膜总体积(或厚度)的1/3计为1分，强化范围为滑膜总体积(或厚度)的2/3计为2分，强化范围为滑膜总体积(或厚度)的全层计为3分；②骨髓水肿评分，无水肿为0分，骨髓水肿体积<33%计为1分，骨髓水肿体积34%～66%计为2分,骨髓水肿体积达67%～100%计为3分；③骨侵蚀评分：无侵蚀为0分，骨侵蚀体积<10%计为1分，骨侵蚀体积达11%～20%计为2分，骨侵蚀体积达21%～30%计为3分，依次类推计分[10]。以上评分过程由2名资深影像学医师进行测评，以均值为最终结果。

1.2.6疾病活动度评价 采用28个关节肿胀关节个数、28个关节压痛关节个数及28个关节疾病活动度评分(DAS28)评价RA患者疾病活动度[11]。

2 结果

2.1两组血清14-3-3η蛋白及mRNA、CRP、RF和抗CCP抗体水平的比较 RA患者血清14-3-3η蛋白及mRNA、ESR、CRP、RF和抗CCP 抗体水平均显著高于正常对照组(均P<0.05)，见表2。

2.2ROC工作曲线分析 如图1，将血清14-3-3η蛋白、CRP、RF和抗CCP 抗体等变量纳入ROC曲线，分析各指标诊断RA的价值，结果显示，14-3-3η蛋白浓度≥1.37 ng/ml时，ROC曲线下面积(AUC)为0.824，灵敏度为84.00%，特异度为81.00%；CRP≥5.98 mg/L时，AUC为0.672，灵敏度为66.00%，特异度为78.50%；RF≥51.93 U/ml时，AUC为0.706，灵敏度为76.00%，特异度为73.40%；抗CCP抗体≥60.86 U/ml时，AUC为0.774，灵敏度为78.00%，特异度为77.20%；见表3。

2.3不同病程RA患者血清14-3-3η蛋白及mRNA表达水平的比较 非早期RA组14-3-3η蛋白及mRNA表达水平显著高于早期RA组(P<0.05)，见表4。

2.4RA患者关节损伤情况 RA患者DAS28评分(7.58±1.58)分，28个关节肿胀关节(13.49±3.42)个，28个关节压痛关节(12.73±3.16)个；滑膜炎评分(1.75±0.86)分，骨髓水肿评分(1.48±0.51)分，骨侵蚀评分(3.26±1.43)分。63例患者出现滑膜炎，累及131个关节区，其中腕骨间+腕掌关节区出现滑膜炎损伤最多，有53个(40.46%)，其他分别为远端桡尺关节区34个，掌指关节区30个，桡腕关节区14个。43例患者出现骨髓水肿，累及122块骨，其中腕骨出现骨髓水肿最多，有65块(53.28%)，包括25块头状骨、12块三角骨、12块钩骨、10块月骨、5块舟骨及1块大多角骨， 其他骨髓水肿发生于近节指骨近端21块、 桡骨远端10块、掌骨远端7块、近节指骨远端7块、掌骨近端6块及尺骨远端6块。67例患者出现骨侵蚀，累及201块骨，其中腕骨出现骨侵蚀最多，有145块(72.14%)，包括69块头状骨、23块三角骨、36块舟骨、17块月骨，其他骨侵蚀发生于掌骨远端27块、近节指骨远端9块、桡骨远端8块、掌骨近端8块及近节指骨近端4块。

Groupsn14-3-3η(ng/ml)14-3-3η mRNACRP(mg/L)RF(U/ml)Anti-CCP antibody(U/ml)Control500.58±0.260.43±0.123.67±1.6515.27±5.3818.34±6.82RA1585.67±1.961)1.16±0.291)16.27±6.541) 85.53±24.161) 247.19±58.431)F18.28317.31413.46720.37227.590P0.0000.0000.0000.0000.000

Note:Compared with control group，1)P<0.05.

2.5血清14-3-3η蛋白表达与实验室及关节损伤指标相关性分析 RA患者血清14-3-3η蛋白与CRP水平、滑膜炎评分、骨髓水肿评分、DAS28评分、28个关节肿胀关节个数及压痛关节个数呈正相关(r/P=0.462/0.039，0.427/0.045，0.384/0.017，0.528/0.032，0.451/0.008，0.419/0.027)，与RF、抗CCP水平及骨侵蚀评分无明显相关性(均P>0.05)。

图1 ROC工作曲线分析Fig.1 ROC curves analysis

表3 14-3-3η和实验室检测指标诊断评价

Tab.3 Diagnosis of 14-3-3η and laboratory test indexes

VariableAUCSensitivity(%)Specificity(%)95%CI14-3-3η0.82484.0081.000.749-0.898CRP0.67266.0078.500.578-0.766RF0.70676.0073.400.621-0.790Anti-CCP antibody0.77478.0077.200.693-0.854

Groupsn14-3-3η(ng/ml)14-3-3η mRNAEarly RA803.24±1.170.83±0.24Non-Early RA787.54±2.431)1.51±0.331)t14.22714.840P0.0000.000

Note:Compared with early RA，1)P<0.05.

3 讨论

14-3-3η蛋白空间结构呈U形，通过U形内部高度保守序列结合相应靶蛋白，参与多种疾病的生物调节过程，如癌症、心血管疾病、糖尿病等[12-14]。随着研究的深入，发现14-3-3η蛋白可激活MAPK/ERK、SAPK/JNK 及JAK-STAT等通路增加促炎细胞因子(如白介素6、肿瘤坏死因子α等)的分泌，具有促炎作用[15]。van Beers-Tas MH等[16]研究显示，14-3-3η蛋白可能通过激活细胞外信号调节激酶1/2和C-Jun氨基末端激酶，参与RA的发生发展。本研究显示RA患者血清14-3-3η蛋白及mRNA水平均显著高于健康对照组，提示14-3-3η蛋白可作为鉴别RA的生物标记物，与曾婷婷[17]等研究报道一致。

RA患者实验室检测指标主要有C反应蛋白(C reactive protein，CRP)、类风湿因子(rheumatoid factor，RF)、抗环瓜氨酸抗体(anti-cyclic citrullinated peptides antibody，抗CCP 抗体)等。RA临床特征为炎性滑膜炎，CRP 可反映体内炎症水平，但对于RA仅能起到初步筛选的作用[18]。RF是首个用于诊断RA的血清因子，具有检测简单易操作、阳性率较高等优点，但应用过程中发现其他感染性疾病及自身免疫病患者中也可检出，特异度较低，对不典型RA患者筛查能力较弱[19]。后来发现抗CCP 抗体水平对RA诊断有较高的价值[20]。通过绘制ROC曲线，发现当14-3-3η蛋白浓度≥1.37 ng/ml时，ROC曲线下面积(AUC)为0.824，灵敏度为84.00%，特异度为81.00%，诊断价值最高；相关性分析显示，RA患者血清14-3-3η蛋白与CRP水平呈正相关，可能与14-3-3η蛋白作用机制有关[21]。表明血清14-3-3η蛋白在RA的诊断中具有一定的价值，可作为RA实验室诊断指标的补充标记物。

核磁共振扫描可以清楚显示关节软骨、滑膜、骨髓、肌腱及韧带等结构，有利于及时发现关节腔积液、滑模炎症增生、关节软骨破坏及骨髓水肿等病症，对早期RA患者关节损伤有较大的优势[22]。本研究通过OMERACT RAMRIS评分系统分析 MRI图像，评价患者关节损伤，发现158例RA患者均伴有不同程度的滑膜炎、骨髓水肿、骨侵蚀等损伤，大多集中在腕部。另外，相关性分析显示，RA患者血清14-3-3η蛋白与滑膜炎评分、骨髓水肿评分、DAS28评分、28个关节肿胀关节个数及压痛关节个数呈正相关。同时，非早期RA组14-3-3η蛋白及mRNA表达水平显著高于早期RA组，以上结果均显示，血清14-3-3η蛋白能够一定程度上预测RA的关节损伤程度，目前，国内外尚未见相关报道，故还需要多中心扩大样本量进一步研究。

综上所述，血清14-3-3η 蛋白可有效辨别RA患者，与患者关节损伤程度密切相关，有助于类风湿关节炎的诊断和病情的预测。但14-3-3η 蛋白在RA中的具体作用机制还需要继续探究，以期为RA患者提供新的治疗方向。