禽流感病毒通用型荧光定量PCR检测试剂盒比对结果分析

2020-06-06吴惠明高晓龙张启龙刘晓冬周德刚

科学技术与工程 2020年12期

吴迪,王林,吴惠明,高晓龙,张启龙,张跃,刘晓冬,周德刚

(北京市动物疫病预防控制中心，北京 102629)

禽流感(avian influenza，AI)是由禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的一种人与动物共患病[1]，引起禽类产生以呼吸系统疾病、产蛋下降乃至急性致死和高死亡率等为特征的烈性传染病，给养禽业带来重大经济损失，家禽感染AIV后，有的不表现临床症状，有的表现为呼吸道疾病和产蛋下降，严重的可导致全身性疾病，死亡率可达100%，而且可导致人的感染和死亡，严重威胁人类健康。

由于禽流感病毒高度的变异型以及新亚型病毒的出现，禽流感的防控面临着严峻的考验。高致病性禽流感暴发突然，发病率和死亡率极高，对家禽饲养业具有毁灭性打击，世界动物卫生组织将其列为法定报告的动物疫病，中华人民共和国农业部公告第1125号对《一、二、三类动物疫病病种名录》进行了修订，将其列为一类动物疫病。农业农村部发布的《国家动物疫病监测与流行病学调查计划》中规定：“对禽流感病原监测阳性个体利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)或荧光定量PCR检测技术进行判定[2]。”地市级动物疫病防控部门已将荧光RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)方法作为初步监测禽流感病毒的首选方法。

实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次PCR循环后产物总量的方法。实时荧光PCR检测技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，被广泛应用于分子生物学、动物疫病研究等领域。目前，市售的国产禽流感病毒荧光定量PCR检测试剂盒具有种类繁多，扩增片段不同，性价比高等特点，但各厂家试剂盒的敏感性、特异性和对可疑区域判定的标准不一[3-5]，导致检测结果或Ct值(cycle threshold，指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)有所偏差，甚至会出现漏检。因此，需要对不同厂家试剂盒进行科学评估，以便为实验室采购禽流感病毒荧光定量PCR检测试剂盒提供理论依据。为此，利用禽流感病毒标准品与临床样品对市售的6种品牌(分别记为A、B、C、D、E、F)禽流感病毒通用型荧光定量PCR检测试剂盒灵敏性与特异性进行了比对，并进行了已经背景临床样品的检测，筛选出禽流感病毒通用型最佳检测试剂盒。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采购北京市场上6家禽流感病毒通用型荧光定量PCR检测试剂盒，分别用A、B、C、D、E、F表示；核酸提取试剂盒(含96孔板)购自杭州博日科技有限公司；禽流感病毒标准品H5、H7、H9亚型鸡胚尿囊液由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；新城疫活疫苗(clone30株)购自辽宁益康生物股份有限公司；鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)购自青岛蔚蓝生物制品有限公司。

1.2 仪器设备

荧光定量PCR仪(美国ABI公司)、TGuide S32全自动核酸提取纯化仪(天根生化科技有限公司)、移液器(德国Eppendorf公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 核酸提取

对H5、H7、H9亚型鸡胚尿囊液标准品及新城疫、禽传染性支气管炎疫苗进行核酸提取：将室温放置96孔板颠倒3次，去除塑封膜后在96孔板离心机中短暂离心，1 000 r/min离心5 min。避免挂液。撕去96孔上的铝箔膜，确认板子方向(磁珠在第6与第12列中)。在96孔板的第1、第7列孔中加入200 μL样品，避免交叉污染。将96孔板放入TGuide S32全自动核酸提取纯化仪中，进行自动化反应，自动化程序结束后，将第5、第11列的洗脱液转移至干净的无核酸酶离心管中，得到50 μL核酸。

1.3.2 敏感性试验

将提取的H7亚型禽流感毒核酸进行10倍倍比稀释，从原液连续稀释至1:108浓度，依据禽流感通用型荧光定量PCR检测试剂盒说明书，按照说明书中提供的反应体系，扩增条件，对各个梯度的H7亚型进行实时荧光RT-PCR检测。

1.3.3 特异性试验

将核酸提取后的H5、H7、H9亚型RNA原液、新城疫活疫苗、鸡新城疫传染性支气管炎活疫苗分别用6个厂家的试剂盒进行荧光定量PCR检测，观察是否出现扩增曲线。

1.3.4 临床样品检测

利用北京市动物疫病预防控制中心保存的97份已知样品，包括7份已知背景的灭活病毒(H7N9、H7N2、H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H9N2)与临床采集保存的90份家禽泄殖腔棉拭子(已知阴性)，对A～F检测试剂盒进行临床检测效果的评价。

2 试剂盒外观及反应时长比对

2.1 试剂盒外观比对

通过对A～F试剂盒外观进行观察发现，A～F试剂盒的外包装完整，标签粘贴完整并不易脱落，溶液清晰透明、无沉淀产生。

2.2 各厂家试剂盒反应体系与反应总时间

比对A～F试剂盒说明书，记录反应体系与计算反应总时间。如表1所示，D试剂盒所用反应时间最短，为42 min 40 s；C试剂盒反应时间最长，为75 min。

表1 试剂盒反应体系及反应总时间Table 1 Reagent box reaction system and total reaction time

2.3 各厂家试剂盒样本结果判定及试剂盒有效性判定区域比较

查看A～F试剂盒说明书，对各厂家试剂盒阴阳性、可疑区域判定范围及试剂盒有效性判定结果进行比对，结果如表2所示。

表2 不同厂家试剂盒有效性判定与样本结果判定区域Table 2 Validity judgment and sample result judgment area of kits from different manufacturers

3 结果

3.1 敏感性试验

对样品3次重复测定取平均Ct。由表3、图1可知，A试剂盒最低检出限为10-2，平均Ct为26.758，检出限为10-3时样品结果为可疑区域；B试剂盒最低检出限为H7的RNA原液，在10-1浓度与10-2浓度下为可疑区域；C试剂盒最低检出限在10-1，检出限为在10-2内有一个样品未检出Ct。D试剂盒最低检出限为10-1，在10-2浓度与10-3浓度下为可疑样品；E试剂盒最低检出限为10-3；F试剂盒最低检出限为10-1，检出限为10-2为可疑样品。

表3 敏感性试验Table 3 Sensitivity Test

图1 各试剂盒灵敏度试验结果Fig.1 Sensitivity test results of each kit

3.2 特异性试验

由表3、图2可知，在6种试剂盒检测H5、H7、H9亚型RNA与试剂盒阳性对照时，均可检出为阳性，在检测新城疫疫苗、鸡新城疫传染性支气管炎活疫苗时，均为阴性，无扩增曲线。在检测H5亚型RNA时，试剂盒A的平均Ct值为15.477，试剂盒C的平均Ct值为24.885，相差9个循环数。在检测H7亚型RNA时，试剂盒A的平均Ct值为19.353，试剂盒C的平均Ct值为27.982，相差8个循环数。在检测H9亚型RNA时，试剂盒A的平均Ct值为18.646，试剂盒C的平均Ct值为30.41，相差12个循环数。

图2 各试剂盒特异性试验结果Fig.2 Specificity Test Results of each F

3.3 临床检测结果

用6种检测试剂盒对实验室保存的97份临床样品进行检测。由表4可知，检出7份阳性与90份阴性，6种禽流感病毒荧光定量PCR检测试剂盒检测结果一致。

4 讨论

禽流感病毒亚型众多加上基因突变、重组和重排，使其变异极快，导致毒株的致病性也千差万别，早期快速诊断无疑是预防、控制禽流感的前提条件[6-7]。实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团[8]，利用荧光信号累计实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。对于荧光定量RT-PCR结果判定，多数情况下需要根据仪器噪声情况调整阈值，阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。一般规定阴性质控对照检测通道读取数据均无Ct值并且无扩增曲线，阳性质控对照检测通道读取数值出现特征性扩增曲线，且Ct值在某范围内，试验成立，否则视为试验无效[9-10]。用的A～F试剂盒，阴阳性质控对照均满足要求，试验成立。

表4 97份样品禽流感病毒荧光定量PCR检测结果Table 4 Fluorescent quantitative PCR results of 97 samples of avian influenza virus

通过检测不同稀释倍数的禽流感H7亚型标准品，对试剂盒的灵敏性、特异性等指标做出了较准确的判定[11]，最终选定的E试剂盒可以作为今后试验参考。

A～F试剂盒的比对检测结果表明，供试的试剂盒均能准确检测出H5、H7、H9亚型核酸，且试剂盒的特异性与敏感性良好，试剂盒的阴阳性对照均成立，结果有效。但在试剂盒敏感性方面A～F试剂盒表现各异，A、D试剂盒的可疑区间范围较大，均为30

A～F试剂盒对阴阳性对照判定及可疑区域判定均不相同，并没有统一的标准，分析原因可能是由于A～F试剂盒采用的扩增目的片段以及技术平台等不尽相同[12]。当样品Ct值落在可疑区域时，给试验室工作人员对结果的判读造成了较大的困扰。初步从特异性、敏感性及物理角度对6个厂家试剂盒进行分析，为今后更加科学地应用测量不确定度对荧光定量PCR试剂盒进行比对奠定了基础[13]。